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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 目的基因与T载体连接后的保存问题
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蓝色泡沫321

银虫 (初入文坛)

[求助] 目的基因与T载体连接后的保存问题已有2人参与

我的目的基因pcr后纯化，转天连接了T载体，但是在-20放了一个半月了，还能转化大肠杆菌吗，如果我直接用T载体测序可不可以进行质量验证呢
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1楼2014-07-11 20:36:13
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leonaliu2013

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-11 21:37:45
蓝色泡沫321: 金币+5, ★★★很有帮助, 非常感谢 2014-07-12 02:33:06
蓝色泡沫321: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-09-23 16:33:15
我以前也有过和你一样的情况，就是连接之后放到-20度，我保存了一周，然后再转化大肠就没有菌落长出了。重复了好几次，都是这样。你可以转化试一下，也许会有菌落长出，也许没有。以后你可以连接之后放到4度保存，因为连接酶在4度是有活性的，所以多放一段时间，最多是体系一直在连接而已，这个我试过，放了4度一周，再转化，能够长出菌落。另外，连接产物测序理论上不可行，因为测序时，需要体系的DNA达到一定浓度，连接产物浓度未必够。而且连接体系里面不仅有T-载体和你片段的连接产物，还有T载体自连产物，如果测序，即使浓度够了能测出来，那么也会是有两个分不开的双峰混在一起。建议涂IPTG和X-gal 加抗性平板，长出白斑，然后PCR验证正确之后，送去测序。
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2楼2014-07-11 21:01:22
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PCR-CL

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流经验！ 2014-07-16 16:05:02
蓝色泡沫321: 金币+5, ★有帮助 2014-09-23 16:33:26
我连接产物-20放过半年，可以长菌。

不可以连接产物直接测序，同意楼上。
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3楼2014-07-12 06:18:08
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