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xiami199008

新虫 (初入文坛)

[求助] 外源基因表达之后 菌液的SDS-PAGE检测时,上样缓冲液里到底要不要加PMSF 已有4人参与

外源基因表达之后 菌液的SDS-PAGE检测时,上样缓冲液里到底要不要加PMSF?
菌液SDS,多是加了上样缓冲液后直接煮沸,看资料上说 煮沸后直接离心点样,貌似没要求加PMSF
但为何超声波破碎的时候要加?
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xiami199008

新虫 (初入文坛)

超声破碎时 是防止你的蛋白讲解,而上样时 你的蛋白在包内,况且时间短,蛋白出来也没那么容易降解,再者 你是要求他变性,煮沸的同时 蛋白酶也失活了,另外,上样buffer 里也 有蛋白酶抑制剂。
看了你上述文字,还是不明白
1、上样时我的蛋白怎么可能在包内呢?
2、煮沸法出来的蛋白全是无活性的?那么超声波出来的可以有活性?
3、什么情况下必须用超声波破碎法?
4、制备抗体的时候必须保证蛋白的活性吗?必须用超声波法吗?
3楼2014-06-13 21:38:34
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biology-girl

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
xiami199008: 金币+2, 有帮助, 有点帮助,但不明确 2014-06-13 21:33:09
超声破碎时 是防止你的蛋白讲解,而上样时 你的蛋白在包内,况且时间短,蛋白出来也没那么容易降解,再者 你是要求他变性,煮沸的同时 蛋白酶也失活了,另外,上样buffer 里也 有蛋白酶抑制剂。
2楼2014-06-13 08:36:08
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赵鑫易

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

2.煮沸是长时间高温,蛋白变性,而超声不是(功率大了也会变性)
3.4.必要,如果是在阳性菌之类的可以用溶菌酶处理的可以不用超声。
4楼2014-09-23 20:14:06
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璧月

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

跑胶样品处理就是把所有蛋白变性,使蛋白展开。超声是把细胞破碎。
超声功率大了也会对蛋白有伤害,温度过热,甚至会碳化,离心后沉淀有块黑。

[ 发自小木虫客户端 ]
5楼2014-09-23 20:26:19
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