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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » SDS-PAGE菌液裂解问题
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weining1203

新虫 (小有名气)

[求助] SDS-PAGE菌液裂解问题

想问问大侠，菌液（BL21DE3）诱导完后，取1ml离心，弃上清，那么沉淀用什么悬浮？还是不用悬浮直接加2*loading buffer 煮沸10min即可，加多少loading buffer？煮沸玩之后还要离心取上清才可以跑电泳吗?还有煮玩可以保存吗，怎么保存？本人小白，问的问题比较幼稚，请做过的同学给点经验，先谢过了
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1楼 2012-11-11 22:02:55
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-12 14:34:01
如果你想做全蛋白是可以直接加上样buffer煮的。不过样品里不仅有可溶蛋白，还有变性的包涵体蛋白。加的量要根据你的菌量多少而定，可以试一下200-400ul什么的。如果样品太浓会造成菌体裂解液粘糊糊的。煮完后需要离心上样。煮过的样品可以放在-20度保存。
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weining1203
2楼2012-11-12 02:29:18
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weining1203

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-12 02:29:18
如果你想做全蛋白是可以直接加上样buffer煮的。不过样品里不仅有可溶蛋白，还有变性的包涵体蛋白。加的量要根据你的菌量多少而定，可以试一下200-400ul什么的。如果样品太浓会造成菌体裂解液粘糊糊的。煮完后需要离 ...

谢谢！还有个问题，如果想把可溶蛋白和包涵体蛋白分开跑，具体应该怎么操作，请指点
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3楼2012-11-12 11:37:22
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hongqifei

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by weining1203 at 2012-11-12 11:37:22
谢谢！还有个问题，如果想把可溶蛋白和包涵体蛋白分开跑，具体应该怎么操作，请指点...

超声破碎，然后离心，包涵体在一般裂解液中不溶。
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何须剑道争锋？千人指，万人封，可问江湖鼎峰，三尺秋水尘不染，天下无双。
4楼2012-11-12 12:07:05
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by weining1203 at 2012-11-12 11:37:22
谢谢！还有个问题，如果想把可溶蛋白和包涵体蛋白分开跑，具体应该怎么操作，请指点...

用不含去垢剂的缓冲液（可以加一些盐和甘油保护蛋白）重悬细菌，超声破碎，离心后上清为可溶蛋白，包涵体和未破碎的细胞在沉淀里。
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weining1203
5楼2012-11-13 07:54:17
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weining1203

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-13 07:54:17
用不含去垢剂的缓冲液（可以加一些盐和甘油保护蛋白）重悬细菌，超声破碎，离心后上清为可溶蛋白，包涵体和未破碎的细胞在沉淀里。...

不含去垢剂的缓冲液什么配方，加多少重悬，超声破碎时超声破碎仪调节到多大，离心多少转，几分钟，上清和包涵体直接加loading buffer就可以跑电泳吗，还用煮沸吗，请详细解答，谢谢您
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6楼2012-11-13 11:21:28
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
weining1203: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢 2012-11-13 19:01:08
缓冲液的配方很多，主要考虑到目的蛋白的性质和下面进一步纯化的工序。一般的缓冲液象Tris, hepes, mes, 磷酸盐都可以。加多少要根据收的菌量来，超声破碎的时间及功率什么的要根据不同的破碎仪及样品的体积、探头大小自己试一下。离心用12000g，时间根据样品体积来定，一般10分钟可以的。上清和沉淀加上样buffer后最好煮一下再跑电泳。
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7楼2012-11-13 13:47:26
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