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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » SDS-PAGE蛋白表达
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ch854355011

新虫 (初入文坛)

[求助] SDS-PAGE蛋白表达 已有7人参与

最近原核表达SDS-PAGE一直没结果。也不知道出现了什么问题。原核表达载体是pet28a，菌BL21，培养基LB，经菌液pcr，酶切和测序，表明重组质粒构建成功，诱导浓度1mmol/L，取样0-5h，但是每次跑出来的条带都一样，没有所需目的条带的表达，目的基因在27或33kd，跑出来的图片每次都没表达，并且条带深浅度一样。求助给点意见。

SDS-PAGE蛋白表达
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1楼 2016-01-26 19:28:47
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

wangpeng8

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能是诱导时间太短了，我们实验室诱导的时间在8小时左右，条件是在低温，如果是在37度，一般诱导3个小时
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且行且珍惜！
3楼2016-01-26 19:54:22
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梅太奇阿拉干

木虫 (小有名气)
是不是有包含体，破碎一下试试？

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2楼2016-01-26 19:53:25
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刘氏响声丸

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
为什么用BL21不用BL21（DE3）？？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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7楼2016-01-27 18:40:07
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梅太奇阿拉干

木虫 (小有名气)
iptg是在od0.4的时候加的吗，1mM会不会有点高，我们实验室都用的0.1-0.5

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10楼2016-03-11 22:59:27
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普通回帖

原海亮

木虫 (著名写手)
你这个是全细胞加热后跑的么，还是细胞超声后跑的上清？建议沉淀也跑一下，看看目的蛋白是不是在沉淀包涵体中。另外不知道你诱导温度，一般低温过夜诱导较好，可以做诱导温度优化。还有iptg诱导浓度可以适当降低些

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
4楼2016-01-26 20:55:00
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tj113578888

金虫 (小有名气)
最好跑个空载做对照，这样更能看出是否有目的条带，还有诱导时间增长

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不求事事顺心，但求问心无愧
5楼2016-01-26 21:10:19
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X小天T

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不知道楼主之前有没有用过这个载体，个人觉得如果是pet-28a载体的话，需要用BL21（DE3）菌株来做宿主菌，可以百度一下BL21和BL21 DE3 的区别。还有可以做个IPTG浓度梯度诱导，时间的话0h意义不大，加长诱导时间。OD值到达0.6时再加IPTG
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6楼2016-01-26 22:03:47
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潇湘夜雨07

新虫 (初入文坛)
诱导时间长点，iptg浓度降低一点，温度降低一点，避免形成包涵体

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8楼2016-01-30 23:39:57
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diaomou

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

是不是用TB培养基更好？
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9楼2016-02-20 15:49:25
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