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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 外源基因表达之后 菌液的SDS-PAGE检测时，上样缓冲液里到底要不要加PMSF
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xiami199008

新虫 (初入文坛)

[求助] 外源基因表达之后 菌液的SDS-PAGE检测时，上样缓冲液里到底要不要加PMSF已有4人参与

外源基因表达之后 菌液的SDS-PAGE检测时，上样缓冲液里到底要不要加PMSF?
菌液SDS，多是加了上样缓冲液后直接煮沸，看资料上说 煮沸后直接离心点样，貌似没要求加PMSF
但为何超声波破碎的时候要加？
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1楼2014-06-13 00:00:50
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biology-girl

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xiami199008: 金币+2, ★有帮助, 有点帮助，但不明确 2014-06-13 21:33:09
超声破碎时 是防止你的蛋白讲解，而上样时 你的蛋白在包内，况且时间短，蛋白出来也没那么容易降解，再者 你是要求他变性，煮沸的同时 蛋白酶也失活了，另外，上样buffer 里也 有蛋白酶抑制剂。
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2楼2014-06-13 08:36:08
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xiami199008

新虫 (初入文坛)
超声破碎时 是防止你的蛋白讲解，而上样时 你的蛋白在包内，况且时间短，蛋白出来也没那么容易降解，再者 你是要求他变性，煮沸的同时 蛋白酶也失活了，另外，上样buffer 里也 有蛋白酶抑制剂。
看了你上述文字，还是不明白
1、上样时我的蛋白怎么可能在包内呢？
2、煮沸法出来的蛋白全是无活性的？那么超声波出来的可以有活性？
3、什么情况下必须用超声波破碎法？
4、制备抗体的时候必须保证蛋白的活性吗？必须用超声波法吗？
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3楼2014-06-13 21:38:34
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赵鑫易

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

2.煮沸是长时间高温，蛋白变性，而超声不是（功率大了也会变性）
3.4.必要，如果是在阳性菌之类的可以用溶菌酶处理的可以不用超声。
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4楼2014-09-23 20:14:06
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璧月

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

跑胶样品处理就是把所有蛋白变性，使蛋白展开。超声是把细胞破碎。
超声功率大了也会对蛋白有伤害，温度过热，甚至会碳化，离心后沉淀有块黑。

[ 发自小木虫客户端 ]
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5楼2014-09-23 20:26:19
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hajierlove

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

不解？超声波是物理破碎方法，加PMSF是化学破碎方法，可以不加PMSF吧？
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踏实
6楼2014-11-24 18:44:39
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