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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 细菌总蛋白SDS-PAGE时菌体处理出现粘稠物？？
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youngsun50

木虫 (正式写手)

[交流] 细菌总蛋白SDS-PAGE时菌体处理出现粘稠物？？

如题，步骤为1ml菌体离心，沉淀加入了100ul的1*SDS凝胶加样缓冲液，100度煮4min,，12000g离心4min,结果没有沉淀出现，均有一坨粘稠物。
请问，各位虫友，这是什么原因？？ 另，有的说煮沸10min,请问煮沸过长对蛋白有影响吗，我的样品为肺炎克雷伯杆菌（G-菌）？
谢谢
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1楼 2011-08-26 16:06:01
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
youngsun50(金币+1):谢谢参与
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good!很精辟的解答！ 2011-08-26 17:39:27
粘稠也是正常的，细胞煮沸之后核酸等物质都释放出来了，但一般离心之后还是有沉淀出来的，取上清上样。我们一般煮沸10min，煮沸过长对SDS-PAGE跑蛋白没有影响的。
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2楼2011-08-26 16:43:34
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friya0910

新虫 (正式写手)
★
youngsun50(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
2楼: Originally posted by lxj341401 at 2011-08-26 16:43:34:
粘稠也是正常的，细胞煮沸之后核酸等物质都释放出来了，但一般离心之后还是有沉淀出来的，取上清上样。我们一般煮沸10min，煮沸过长对SDS-PAGE跑蛋白没有影响的。

您好，我想请问一下，我今天做诱导，取500微升菌液，12000rpm离心1min，弃上清，用50微升灭菌水重悬后加50微升2×上样buffer，然后100℃煮沸5min，12000rpm离心1min，然后取上清，20微升装一管，可是当我吸到最后的时候没有看到有沉淀啊？也没像楼上说的出现粘稠，是不是没裂解好啊？因为上样buffer颜色太深了，沉淀也不是特别容易观察，我想请问你们都能看到沉淀吗？
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3楼2011-08-26 17:53:03
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by friya0910 at 2011-08-26 17:53:03:
您好，我想请问一下，我今天做诱导，取500微升菌液，12000rpm离心1min，弃上清，用50微升灭菌水重悬后加50微升2×上样buffer，然后100℃煮沸5min，12000rpm离心1min，然后取上清，20微升装一管，可是当我吸到最后 ...

正如你说的，沉淀不容易看到的。不黏稠和没看到沉淀不能代表没处理好。按照你的方法处理一般没问题的。
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4楼2011-08-26 19:43:24
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youngsun50

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lxj341401 at 2011-08-26 16:43:34:
粘稠也是正常的，细胞煮沸之后核酸等物质都释放出来了，但一般离心之后还是有沉淀出来的，取上清上样。我们一般煮沸10min，煮沸过长对SDS-PAGE跑蛋白没有影响的。

请问，那为什么一般情况没有粘稠物这情况呢，是不是我的菌过浓啊，另G-菌煮沸10min没问题吧？？
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5楼2011-08-26 22:14:10
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by youngsun50 at 2011-08-26 22:14:10:
请问，那为什么一般情况没有粘稠物这情况呢，是不是我的菌过浓啊，另G-菌煮沸10min没问题吧？？

粘稠跟菌的量、菌的种类都有关系的，不要纠结是否黏稠，把握一个原则：上样的时候尽量取上清。
我们经常使用的大肠杆菌也是典型的G-菌，煮沸10min都没问题的。
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6楼2011-08-27 08:09:57
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youngsun50

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lxj341401 at 2011-08-27 08:09:57:
粘稠跟菌的量、菌的种类都有关系的，不要纠结是否黏稠，把握一个原则：上样的时候尽量取上清。
我们经常使用的大肠杆菌也是典型的G-菌，煮沸10min都没问题的。

谢谢
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7楼2011-08-27 09:35:54
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