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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » SDS-PAGE泳道形状诡异
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

[求助] SDS-PAGE泳道形状诡异

跑SDS-PAGE把细胞裂解液上样结果跑出来这么奇怪的形状(最右边两个泳道)
我可以保证不是胶制备的问题, 换了好几块胶了
上样的时候其他的泳道都没问题,就是只要把这个细胞裂解液加上去,对应的泳道就肯定就跑成这鬼样子
电解缓冲液也没问题, 实验室其他人拿我配的缓冲液跑都没事
大概就是这裂解液样品的问题....请问这是不是盐浓度太高了?还是盐浓度太低了?我这里面还有少量NP-40,不应该影响吧？大概还会残留一些养细胞用的MEM...
见了鬼了，按理说我这缓冲液最多只是PBS
SDS-PAGE泳道形状诡异
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
1楼 2013-10-05 08:21:08
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同东中郎将

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-05 17:01:36
fuyuandj86: 金币+4, ★★★很有帮助 2013-10-06 01:08:52
这位同学，你的上样量太大了的结果，可以把你的样品先稀释一下再上样。先稀释5倍看看吧，不行的话少上一点，上样量蛋白太多了。
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曾子曰：“士不可以不弘毅，任重而道远。仁以为己任，不亦重乎？死而后已，不亦远乎？”
2楼2013-10-05 08:57:35
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feipiaolw

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2013-10-05 17:01:43
fuyuandj86: 金币+2, ★有帮助 2013-10-06 01:09:07
上样量太大，或者把裂解液过滤纯化下再电泳。
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学术一点，挺好的，要坚持
3楼2013-10-05 09:24:45
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yonghuixie

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-10-05 17:01:50
fuyuandj86: 金币+2, ★有帮助 2013-10-06 01:09:28
本帖内容被屏蔽
4楼2013-10-05 14:28:51
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ljj0720

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
fuyuandj86: 金币+2, ★有帮助 2013-10-06 01:09:38
你试试离心取上清上样
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5楼2013-10-05 21:29:07
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chancety

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
样品制备的问题，不是跑胶的问题，建议重新做样品再跑胶看看

[ 发自手机版 https://muchong.com/3g ]
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set up my company!
6楼2013-10-06 01:07:25
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makubex83

至尊木虫 (知名作家)
上样量太大，逐步两倍的稀释一下，跑一下就知道了
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7楼2013-10-06 23:05:39
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
楼主的样品电泳时不仅带非常宽甚至可以说是弥散，所以不可能是段春上样过多的问题，样品处理的也不好。电压也可考虑调整。
1.样品处理（充分溶解样品）：根据样品分离目的不同，在上样前对样品进行的溶解处理主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。
（1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT(或Beta巯基乙醇)后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。
（2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100μl样品缓冲液中10μl 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。
（3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。
2.保持各种蛋白质样品和Marker在上样前能够充分溶解，上样前最好离心一下，实在溶解不掉的颗粒就去掉。
3.减少上样量，楼主的样品应该稀释十倍后再上样。
4.可以考虑加高电泳时，浓缩胶的电压为90-100 V，分离胶的电压到120V-200V，；浓缩胶和分离胶有时候可能都设成150 V也能电泳成功。
5.上样前要煮沸样品蛋白质。
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8楼2013-10-07 15:01:11
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
更准确的回答：

楼主的电泳问题是SDS电泳带弥散、拖尾，原因和解决方法如下（我今天下午刚写好的材料）：

SDS电泳带弥散和拖尾的原因和改进措施(2013-10-7)

1.原因一：上样量过多，应该减少上样量。对策：加样体积根据样品浓度和凝胶厚度灵活掌握。一般上样体积为10-15µL（即2-10µg蛋白质）。如果样品很稀上样量可以达到100µL。
2.原因二：样品溶解不完全。
对策：
（1）样品应该充分溶解：保持各种蛋白质样品和Marker在上样前能够充分溶解，上样前最好离心一下，实在溶解不掉的颗粒就去掉。
(2)可以根据分子量标准的蛋白质试剂盒的要求加入样品溶解液；如果是自行配置标准和未知样品，按照0.5-1.0mg/L样品溶解液。溶解后，将其转移至Eppendorf管，盖上盖子（可以在盖子处加上卡子）后在110度沸水中水浴加热3分钟（可以在薄泡沫塑料板上钻出几个与Eppendorf管直径形同的圆洞，Eppendorf管放下去直到盖子边缘约束不能再往下为止，把薄泡沫塑料板的暴露出Eppendorf管的管体大部分的那一面放入沸水浴锅中，薄泡沫塑料板自然飘在沸水表面，便于取用和加热，也可避免沸水溅起。可以一批对于多个Eppendorf管进行不同时间的沸水浴。不要把Eppendorf管扔进沸水浴锅中，盖子可能会被冲开），而后在室温下冷却待用。如果较长时间不用，则将样品放入零下20度冰箱中储存，需用时在取出后使用前在110度沸水中加热3分钟室温冷却后再上样，以去掉样品蛋白质中的亚稳态聚合体。
（3）改变样品缓冲溶液使得样品能够充分溶解，SDS 用量要充分。
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9楼2013-10-07 16:26:50
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