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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

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[求助] SDS-PAGE泳道形状诡异

跑SDS-PAGE把细胞裂解液上样结果跑出来这么奇怪的形状(最右边两个泳道)
我可以保证不是胶制备的问题, 换了好几块胶了
上样的时候其他的泳道都没问题,就是只要把这个细胞裂解液加上去,对应的泳道就肯定就跑成这鬼样子
电解缓冲液也没问题, 实验室其他人拿我配的缓冲液跑都没事
大概就是这裂解液样品的问题....请问这是不是盐浓度太高了?还是盐浓度太低了?我这里面还有少量NP-40,不应该影响吧？大概还会残留一些养细胞用的MEM...
见了鬼了，按理说我这缓冲液最多只是PBS

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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.

1楼 2013-10-05 08:21:08

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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

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楼主的样品电泳时不仅带非常宽甚至可以说是弥散，所以不可能是段春上样过多的问题，样品处理的也不好。电压也可考虑调整。
1.样品处理（充分溶解样品）：根据样品分离目的不同，在上样前对样品进行的溶解处理主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。
（1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT(或Beta巯基乙醇)后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。
（2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100μl样品缓冲液中10μl 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。
（3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。
2.保持各种蛋白质样品和Marker在上样前能够充分溶解，上样前最好离心一下，实在溶解不掉的颗粒就去掉。
3.减少上样量，楼主的样品应该稀释十倍后再上样。
4.可以考虑加高电泳时，浓缩胶的电压为90-100 V，分离胶的电压到120V-200V，；浓缩胶和分离胶有时候可能都设成150 V也能电泳成功。
5.上样前要煮沸样品蛋白质。