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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 关于蓝白斑筛选遇到的问题，T载体不做任何处理直接转化后长篮斑是什么问题？
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Dylan苏木樨

新虫 (小有名气)

[求助] 关于蓝白斑筛选遇到的问题，T载体不做任何处理直接转化后长篮斑是什么问题？ 已有2人参与

之前做蓝白斑筛选一直没什么问题。最近做总是不出白斑，刚开始以为是pcr的问题，昨天做转化的时候将T载体什么处理都不做直接转化然后涂版，今天早上一看竟然也是一片蓝斑，和做连接之后转化的没什么区别，这是不是能说明这一批T载体不好？大神们指点一下拜谢。
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1楼 2014-06-06 19:05:44
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liug268

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
首先，我认为不出白斑不一定不是正确的克隆，蓝白斑我现在不怎么用了，基本都是用菌落PCR筛。
其次，T载体理论上本身不能环化，如果是在抗性板子上能长出菌落就说明可能存在污染问题。
希望能帮到你
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2楼2014-06-06 20:06:18
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hailunl

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
估计是连接的问题。
1、你克隆用的是什么酶？是不是平末端？
TA克隆平末端要加A的尾才能连上。
2、克隆产物回收，直接用水，不要用TE.
TE盐离子严重影响连接效率。
16℃连接最好3h~12h.
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3楼2014-06-06 20:07:10
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Dylan苏木樨

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hailunl at 2014-06-06 20:07:10
估计是连接的问题。
1、你克隆用的是什么酶？是不是平末端？
TA克隆平末端要加A的尾才能连上。
2、克隆产物回收，直接用水，不要用TE.
TE盐离子严重影响连接效率。
16℃连接最好3h~12h.

酶没有问题，是TAKARA的ExTaq，我试试不用TE回收吧。谢了

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4楼2014-06-06 20:51:08
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Dylan苏木樨

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by liug268 at 2014-06-06 20:06:18
首先，我认为不出白斑不一定不是正确的克隆，蓝白斑我现在不怎么用了，基本都是用菌落PCR筛。
其次，T载体理论上本身不能环化，如果是在抗性板子上能长出菌落就说明可能存在污染问题。
希望能帮到你

的确是抗性的平板上，我觉得有问题，因为之前怎么做都没有问题的

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5楼2014-06-06 20:52:54
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