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Dylan苏木樨

新虫 (小有名气)

[求助] 关于蓝白斑筛选遇到的问题,T载体不做任何处理直接转化后长篮斑是什么问题? 已有2人参与

之前做蓝白斑筛选一直没什么问题。最近做总是不出白斑,刚开始以为是pcr的问题,昨天做转化的时候将T载体什么处理都不做直接转化然后涂版,今天早上一看竟然也是一片蓝斑,和做连接之后转化的没什么区别,这是不是能说明这一批T载体不好?大神们指点一下拜谢。
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hailunl

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
估计是连接的问题。
1、你克隆用的是什么酶?是不是平末端?
TA克隆平末端要加A的尾才能连上。
2、克隆产物回收,直接用水,不要用TE.
TE盐离子严重影响连接效率。
16℃连接最好3h~12h.
3楼2014-06-06 20:07:10
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liug268

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
首先,我认为不出白斑不一定不是正确的克隆,蓝白斑我现在不怎么用了,基本都是用菌落PCR筛。
其次,T载体理论上本身不能环化,如果是在抗性板子上能长出菌落就说明可能存在污染问题。
希望能帮到你
2楼2014-06-06 20:06:18
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Dylan苏木樨

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by hailunl at 2014-06-06 20:07:10
估计是连接的问题。
1、你克隆用的是什么酶?是不是平末端?
TA克隆平末端要加A的尾才能连上。
2、克隆产物回收,直接用水,不要用TE.
TE盐离子严重影响连接效率。
16℃连接最好3h~12h.

酶没有问题,是TAKARA的ExTaq,我试试不用TE回收吧。谢了

[ 发自小木虫客户端 ]
4楼2014-06-06 20:51:08
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Dylan苏木樨

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by liug268 at 2014-06-06 20:06:18
首先,我认为不出白斑不一定不是正确的克隆,蓝白斑我现在不怎么用了,基本都是用菌落PCR筛。
其次,T载体理论上本身不能环化,如果是在抗性板子上能长出菌落就说明可能存在污染问题。
希望能帮到你

的确是抗性的平板上,我觉得有问题,因为之前怎么做都没有问题的

[ 发自小木虫客户端 ]
5楼2014-06-06 20:52:54
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