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SYBR green表达，扩增效率
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| 用SYBR green相对定量，自己用5个梯度做标准曲线，目的基因的扩增效率只有87%，内参基因有92%，这两对引物可以做定量表达分析吗？ |
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kellytan001
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【答案】应助回帖
| 荧光定量PCR分析基因表达有两种方法：1、是标准品法。这种方法要求有已经知道的拷贝数。不需要内参。不同拷贝数得到不同ct值。做出方程计算未知样品的拷贝数。2、是相对内参方法。这种方法要求内参，并且每组要分别对应内参，分析数据时将内参减去。不需要标准品。楼主说的标准曲线应该是这样理解的：对于PCR扩增，无法达到100%。所以为了保证反应体系具备很好的扩增效率（重点取决于引物的好坏），我们就尝试做标准曲线检测反应体系的扩增效率。delta delta统计方法的使用要求扩增效率达到95%-105%之间。3、扩增效率的做法：就是用任意一组的cDNA进行10浓度稀释，加入引物。一般为5-7个梯度，每个梯度为4个副孔。完成后pcr仪器会给你一个曲线和方程。求出斜率计算出扩增效率，严格上讲如果不在95%-105%之间是需要换引物的。 |
2楼2014-05-04 12:20:04