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丫头“笑笑”

银虫 (小有名气)

[求助] hepg2 细胞复苏 已有8人参与

我一个月前冻存的细胞,复苏两次了,都以失败告终啊。复苏时细胞量挺多的,但过夜后贴壁的细胞极少,换液后就剩一点儿了。如下图:



继续培养几天就这样了:



知道怎么回事嘛?我的冻存步骤是:收集细胞,加入1ml冻存液(10%DMSO)。4度10min,20度30min,-80度过夜,然后保存在液氮中。
复苏步骤是:从液氮中取出一管细胞后立即放入37度水浴中解冻,快速解冻后,再加入新鲜培养基过夜培养,换液。


能看出我的问题在哪嘛?
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我要我的自由!
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ohneyzhang

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我和楼主遇到的问题一样,细胞也不是污染,就是状态很差!我的问题是出在血清了。换BI血清后长势迅猛。
10楼2014-04-25 23:28:47
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普通回帖

kueradi

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
可以试一试复苏的时候将冻存的细胞转入15ml离心管中,再向其中加入10ml培养基混匀,离心弃去上清,加入培养基重悬,最后加入培养皿中,过夜。
如果直接将冻存的细胞加入培养皿中的培养液,我们一般都是细胞贴壁(6h左右)后换液,因为DMSO长时间可能对一些细胞有损伤。
2楼2014-04-25 14:52:20
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yu756849034

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
不知道你的细胞悬液的量是多少? 你的细胞在4℃放置的时间有点少,不过你的复苏应该是没有问题的。我们实验室的细胞冻存步骤是每一盘细胞用2ml10%的细胞冻存液制细胞悬液,然后分装到两个细胞冻存管中,20℃30min,4℃1h,-20℃2h,-80℃过夜,在转移至液氮之中。每次都能够复苏成功,试了好多次是没有问题的。
不过现在我们实验室买了梯度冻存盒,细胞冻存管密封完之后直接放到梯度冻存盒中放入-80℃过夜,在转移至液氮之中就行了。
不作死不会死!!!
3楼2014-04-25 16:14:44
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丫头“笑笑”

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by kueradi at 2014-04-25 14:52:20
可以试一试复苏的时候将冻存的细胞转入15ml离心管中,再向其中加入10ml培养基混匀,离心弃去上清,加入培养基重悬,最后加入培养皿中,过夜。
如果直接将冻存的细胞加入培养皿中的培养液,我们一般都是细胞贴壁(6 ...

我也有试过离心后再培养,一样不行的。
我要我的自由!
4楼2014-04-25 16:57:22
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丫头“笑笑”

银虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by yu756849034 at 2014-04-25 16:14:44
不知道你的细胞悬液的量是多少? 你的细胞在4℃放置的时间有点少,不过你的复苏应该是没有问题的。我们实验室的细胞冻存步骤是每一盘细胞用2ml10%的细胞冻存液制细胞悬液,然后分装到两个细胞冻存管中,20℃30min, ...

我是一个大平皿的细胞用1ml冻存液。细胞量特别大。是不是细胞量太大也不行?
我要我的自由!
5楼2014-04-25 16:58:17
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kueradi

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 丫头“笑笑” at 2014-04-25 16:57:22
我也有试过离心后再培养,一样不行的。...

如果是这样,那基本就是细胞冻坏了。冻存有问题。我们实验室用的是梯度冻存盒,所以不确定你冻存细胞的方式是否合适。
6楼2014-04-25 17:36:30
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kueradi

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 丫头“笑笑” at 2014-04-25 16:58:17
我是一个大平皿的细胞用1ml冻存液。细胞量特别大。是不是细胞量太大也不行?...

细胞量还好,因为HepG2团块生长,传稀了长得太慢,我也是1:1冻,细胞太满的时候1:2冻。
7楼2014-04-25 17:39:13
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yu756849034

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 丫头“笑笑” at 2014-04-25 16:58:17
我是一个大平皿的细胞用1ml冻存液。细胞量特别大。是不是细胞量太大也不行?...

细胞量与冻存液的量一般是一比一的。你那样估计是冻存方式上出现了问题了!

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
不作死不会死!!!
8楼2014-04-25 22:45:05
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wys476488620

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
不太清楚楼主的细胞怎么回事  先说说我的吧  冻存 10%DMSO 40%血清 50%培养液 十的六次方细胞
4度1H  -20度 1H  -80度1H  液氮  
复苏  37度 速溶  然后加到50毫升离心管(加20毫升无血清培养基 ) 1000rpm 10min 4℃  弃上清
10%血清培养液 重悬 加合适的培养液在合适的培养瓶培养  

希望和楼主共同进步  养细胞确实是 一门技术活 用我老师的话说比养孩子都难
踏踏实实的就行了
9楼2014-04-25 22:58:09
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