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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 细胞科学 » hepg2 细胞复苏
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丫头“笑笑”

银虫 (小有名气)

[求助] hepg2 细胞复苏 已有8人参与

我一个月前冻存的细胞，复苏两次了，都以失败告终啊。复苏时细胞量挺多的，但过夜后贴壁的细胞极少，换液后就剩一点儿了。如下图：



继续培养几天就这样了：



知道怎么回事嘛？我的冻存步骤是：收集细胞，加入1ml冻存液（10%DMSO）。4度10min，20度30min，-80度过夜，然后保存在液氮中。
复苏步骤是：从液氮中取出一管细胞后立即放入37度水浴中解冻，快速解冻后，再加入新鲜培养基过夜培养，换液。


能看出我的问题在哪嘛？
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我要我的自由！
1楼 2014-04-25 13:48:36
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

ohneyzhang

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我和楼主遇到的问题一样，细胞也不是污染，就是状态很差！我的问题是出在血清了。换BI血清后长势迅猛。
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10楼2014-04-25 23:28:47
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普通回帖

kueradi

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以试一试复苏的时候将冻存的细胞转入15ml离心管中，再向其中加入10ml培养基混匀，离心弃去上清，加入培养基重悬，最后加入培养皿中，过夜。
如果直接将冻存的细胞加入培养皿中的培养液，我们一般都是细胞贴壁（6h左右）后换液，因为DMSO长时间可能对一些细胞有损伤。
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2楼2014-04-25 14:52:20
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yu756849034

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不知道你的细胞悬液的量是多少？ 你的细胞在4℃放置的时间有点少，不过你的复苏应该是没有问题的。我们实验室的细胞冻存步骤是每一盘细胞用2ml10%的细胞冻存液制细胞悬液，然后分装到两个细胞冻存管中，20℃30min，4℃1h，-20℃2h，-80℃过夜，在转移至液氮之中。每次都能够复苏成功，试了好多次是没有问题的。
不过现在我们实验室买了梯度冻存盒，细胞冻存管密封完之后直接放到梯度冻存盒中放入-80℃过夜，在转移至液氮之中就行了。
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不作死不会死！！！
3楼2014-04-25 16:14:44
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丫头“笑笑”

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kueradi at 2014-04-25 14:52:20
可以试一试复苏的时候将冻存的细胞转入15ml离心管中，再向其中加入10ml培养基混匀，离心弃去上清，加入培养基重悬，最后加入培养皿中，过夜。
如果直接将冻存的细胞加入培养皿中的培养液，我们一般都是细胞贴壁（6 ...

我也有试过离心后再培养，一样不行的。
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我要我的自由！
4楼2014-04-25 16:57:22
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丫头“笑笑”

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yu756849034 at 2014-04-25 16:14:44
不知道你的细胞悬液的量是多少？ 你的细胞在4℃放置的时间有点少，不过你的复苏应该是没有问题的。我们实验室的细胞冻存步骤是每一盘细胞用2ml10%的细胞冻存液制细胞悬液，然后分装到两个细胞冻存管中，20℃30min， ...

我是一个大平皿的细胞用1ml冻存液。细胞量特别大。是不是细胞量太大也不行？
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我要我的自由！
5楼2014-04-25 16:58:17
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kueradi

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 丫头“笑笑” at 2014-04-25 16:57:22
我也有试过离心后再培养，一样不行的。...

如果是这样，那基本就是细胞冻坏了。冻存有问题。我们实验室用的是梯度冻存盒，所以不确定你冻存细胞的方式是否合适。
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6楼2014-04-25 17:36:30
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kueradi

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 丫头“笑笑” at 2014-04-25 16:58:17
我是一个大平皿的细胞用1ml冻存液。细胞量特别大。是不是细胞量太大也不行？...

细胞量还好，因为HepG2团块生长，传稀了长得太慢，我也是1：1冻，细胞太满的时候1:2冻。
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7楼2014-04-25 17:39:13
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yu756849034

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 丫头“笑笑” at 2014-04-25 16:58:17
我是一个大平皿的细胞用1ml冻存液。细胞量特别大。是不是细胞量太大也不行？...

细胞量与冻存液的量一般是一比一的。你那样估计是冻存方式上出现了问题了！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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不作死不会死！！！
8楼2014-04-25 22:45:05
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wys476488620

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不太清楚楼主的细胞怎么回事  先说说我的吧  冻存 10%DMSO 40%血清 50%培养液 十的六次方细胞
4度1H  -20度 1H  -80度1H  液氮  
复苏  37度 速溶  然后加到50毫升离心管（加20毫升无血清培养基 ） 1000rpm 10min 4℃  弃上清
10%血清培养液 重悬 加合适的培养液在合适的培养瓶培养  

希望和楼主共同进步  养细胞确实是 一门技术活 用我老师的话说比养孩子都难
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踏踏实实的就行了
9楼2014-04-25 22:58:09
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