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丫头“笑笑”

银虫 (小有名气)

[求助] hepg2 细胞复苏 已有8人参与

我一个月前冻存的细胞,复苏两次了,都以失败告终啊。复苏时细胞量挺多的,但过夜后贴壁的细胞极少,换液后就剩一点儿了。如下图:



继续培养几天就这样了:



知道怎么回事嘛?我的冻存步骤是:收集细胞,加入1ml冻存液(10%DMSO)。4度10min,20度30min,-80度过夜,然后保存在液氮中。
复苏步骤是:从液氮中取出一管细胞后立即放入37度水浴中解冻,快速解冻后,再加入新鲜培养基过夜培养,换液。


能看出我的问题在哪嘛?
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我要我的自由!
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wys476488620

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
不太清楚楼主的细胞怎么回事  先说说我的吧  冻存 10%DMSO 40%血清 50%培养液 十的六次方细胞
4度1H  -20度 1H  -80度1H  液氮  
复苏  37度 速溶  然后加到50毫升离心管(加20毫升无血清培养基 ) 1000rpm 10min 4℃  弃上清
10%血清培养液 重悬 加合适的培养液在合适的培养瓶培养  

希望和楼主共同进步  养细胞确实是 一门技术活 用我老师的话说比养孩子都难
踏踏实实的就行了
9楼2014-04-25 22:58:09
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kueradi

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
可以试一试复苏的时候将冻存的细胞转入15ml离心管中,再向其中加入10ml培养基混匀,离心弃去上清,加入培养基重悬,最后加入培养皿中,过夜。
如果直接将冻存的细胞加入培养皿中的培养液,我们一般都是细胞贴壁(6h左右)后换液,因为DMSO长时间可能对一些细胞有损伤。
2楼2014-04-25 14:52:20
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yu756849034

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
不知道你的细胞悬液的量是多少? 你的细胞在4℃放置的时间有点少,不过你的复苏应该是没有问题的。我们实验室的细胞冻存步骤是每一盘细胞用2ml10%的细胞冻存液制细胞悬液,然后分装到两个细胞冻存管中,20℃30min,4℃1h,-20℃2h,-80℃过夜,在转移至液氮之中。每次都能够复苏成功,试了好多次是没有问题的。
不过现在我们实验室买了梯度冻存盒,细胞冻存管密封完之后直接放到梯度冻存盒中放入-80℃过夜,在转移至液氮之中就行了。
不作死不会死!!!
3楼2014-04-25 16:14:44
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丫头“笑笑”

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by kueradi at 2014-04-25 14:52:20
可以试一试复苏的时候将冻存的细胞转入15ml离心管中,再向其中加入10ml培养基混匀,离心弃去上清,加入培养基重悬,最后加入培养皿中,过夜。
如果直接将冻存的细胞加入培养皿中的培养液,我们一般都是细胞贴壁(6 ...

我也有试过离心后再培养,一样不行的。
我要我的自由!
4楼2014-04-25 16:57:22
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