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致远012

金虫 (初入文坛)

精灵

[求助] 8kbp怎么做PCR? 已有5人参与

如何从人的全基因组PCR得到一段8Kbp左右的目的片段,谢谢各位大神!
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我有一颗勇敢的心。
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
致远012: 金币+1, 有帮助, 最少分成几个片段呢? 2014-04-03 09:11:04
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-04-03 12:08:30
用扩长片段的酶LongAMP试试,很多公司都有。
hehe
2楼2014-04-03 07:49:10
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d00614028

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
致远012: 金币+1, 会不会出现连不上的情况呢? 2014-04-03 09:10:31
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-04-03 12:08:36
也可以1K, 1K的PCR,然后做overlap
3楼2014-04-03 08:35:19
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致远012

金虫 (初入文坛)

精灵

引用回帖:
2楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-04-03 07:49:10
用扩长片段的酶LongAMP试试,很多公司都有。

一般至少P几次啊?
我有一颗勇敢的心。
4楼2014-04-03 09:03:26
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致远012

金虫 (初入文坛)

精灵

引用回帖:
3楼: Originally posted by d00614028 at 2014-04-03 08:35:19
也可以1K, 1K的PCR,然后做overlap

会不会出现连不上的情况呢?
我有一颗勇敢的心。
5楼2014-04-03 09:04:00
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d00614028

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 致远012 at 2014-04-03 09:04:00
会不会出现连不上的情况呢?...

设计引物的时候在相邻引物间设置30bp长的overlap区,这样的话先1K P出来然后做overlap。
6楼2014-04-03 09:14:36
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lihe131

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-04-03 12:08:50
如果可以找到适当的酶切位点的话,可以先将一部分克隆出来,然后以此为载体,再将另外一部分连进去。
7楼2014-04-03 09:32:38
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 致远012 at 2014-04-03 09:03:26
一般至少P几次啊?...

P一次就可以了
hehe
8楼2014-04-03 16:59:58
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-06 16:21:01
clontech的Advantage2 可以做到,一次就OK

[ 发自小木虫客户端 ]
9楼2014-04-06 14:41:11
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hufangzhou

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-04-06 16:21:17
引物设计24bp以上,用LA taq(很多公司都有,我一般用Takara的),用两步法跑,一般是先94℃ 退火5min,接着98℃ 10s, 68℃ 8min(1kb每分钟),30cycles,最后72℃延伸10min。我用此方法跑过8k多的,只是模板DNA的质量要求相对高一点,楼主可以试试。
10楼2014-04-06 16:06:13
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