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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 8kbp怎么做PCR?
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致远012

金虫 (初入文坛)

精灵

[求助] 8kbp怎么做PCR? 已有5人参与

如何从人的全基因组PCR得到一段8Kbp左右的目的片段，谢谢各位大神！
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我有一颗勇敢的心。
1楼 2014-04-02 22:34:22
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
致远012: 金币+1, ★有帮助, 最少分成几个片段呢？ 2014-04-03 09:11:04
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-04-03 12:08:30
用扩长片段的酶LongAMP试试，很多公司都有。
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hehe
2楼2014-04-03 07:49:10
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d00614028

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
致远012: 金币+1, 会不会出现连不上的情况呢? 2014-04-03 09:10:31
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-04-03 12:08:36
也可以1K, 1K的PCR，然后做overlap
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3楼2014-04-03 08:35:19
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致远012

金虫 (初入文坛)

精灵
引用回帖:
2楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-04-03 07:49:10
用扩长片段的酶LongAMP试试，很多公司都有。

一般至少P几次啊？
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我有一颗勇敢的心。
4楼2014-04-03 09:03:26
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致远012

金虫 (初入文坛)

精灵
引用回帖:
3楼: Originally posted by d00614028 at 2014-04-03 08:35:19
也可以1K, 1K的PCR，然后做overlap

会不会出现连不上的情况呢？
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我有一颗勇敢的心。
5楼2014-04-03 09:04:00
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d00614028

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 致远012 at 2014-04-03 09:04:00
会不会出现连不上的情况呢？...

设计引物的时候在相邻引物间设置30bp长的overlap区，这样的话先1K P出来然后做overlap。
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6楼2014-04-03 09:14:36
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lihe131

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-04-03 12:08:50
如果可以找到适当的酶切位点的话，可以先将一部分克隆出来，然后以此为载体，再将另外一部分连进去。
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7楼2014-04-03 09:32:38
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 致远012 at 2014-04-03 09:03:26
一般至少P几次啊？...

P一次就可以了
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hehe
8楼2014-04-03 16:59:58
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Neo2000

木虫 (著名写手)

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★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-06 16:21:01
clontech的Advantage2 可以做到，一次就OK

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9楼2014-04-06 14:41:11
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hufangzhou

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-04-06 16:21:17
引物设计24bp以上，用LA taq（很多公司都有，我一般用Takara的），用两步法跑，一般是先94℃ 退火5min，接着98℃ 10s， 68℃ 8min（1kb每分钟），30cycles，最后72℃延伸10min。我用此方法跑过8k多的，只是模板DNA的质量要求相对高一点，楼主可以试试。
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10楼2014-04-06 16:06:13
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