24小时热门版块排行榜

返回列表

yaojuan1990

金虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 628
帖子: 101
在线: 18.4小时
虫号: 2681182
注册: 2013-09-25
专业: 临床分子生物学检验

[求助] 如何设计引物已有1人参与

小白一枚，求教如何设计引物，有教程最好，急求，谢谢

回复此楼

» 猜你喜欢

拿不到项目没关系《广西披露一高校获 1.31 亿科研经费，成果转化为 0》已经有55人回复
为啥又有个山西的兄弟在这里招摇呀不累么？已经有13人回复
泌尿系统论文润色/翻译怎么收费? 已经有295人回复
寻求能在电脑上支持回放各地电视节目的软件已经有0人回复
壳聚糖紫外吸收标曲可以做吗？已经有0人回复
纳米颗粒离心无法完全沉淀已经有0人回复
欧洲博后是否有招1年的？已经有5人回复
求调剂！306临床医学考生 305，英语一47 已经有0人回复

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

求助，NCBI设计的引物怎么看好不好？急呀。。。。。已经有5人回复
如何设计点突变引物？已经有14人回复
用基因组DNA进行PCR怎么设计引物啊已经有10人回复
如何通过设计引物，插入三个新的DNA碱基已经有4人回复
已知cds序列如何设计引物克隆全长已经有4人回复
新人做qRT-PCR 引物怎么设计？已经有5人回复
如何核对设计好的基因引物序列已经有3人回复
扩增基因CDS区域如何设计引物？已经有36人回复
引物设计跨内含子，操作中如何快速实现？已经有9人回复
如何设计引物扩增片段？做克隆的已经有11人回复
特异性Promoter引物该怎么设计啊已经有6人回复
如何通过已知序列设计引物获得该基因的全序列？已经有12人回复
如何根据CDS序列设计引物已经有3人回复
载体构建技术请教，如何设计引物提取基因插入载体中？已经有3人回复
利用Primer 5设计引物问题已经有6人回复
已经带his标签目的蛋白基因如何设计引物啊（目的基因已经接在pET-22b的载体上了）已经有8人回复
如何设计重叠延伸PCR引物已经有14人回复
【求助/交流】怎样设计目的基因的引物已经有8人回复
【求助/交流】同源克隆设计的引物Tm值过低怎么办已经有12人回复
【求助/交流】已知N端11个氨基酸序列如何设计引物已经有6人回复
克隆基因全长引物设计问题已经有32人回复
引物设计求助~ 已经有13人回复

1楼2014-03-25 17:36:35

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

jms_guan

专家顾问 (著名写手)

MedEPI: 7
应助: 70 (初中生)
贵宾: 0.017
金币: 4734.7
散金: 546
红花: 14
帖子: 1101
在线: 121.3小时
虫号: 845276
注册: 2009-09-11
性别: GG
专业: 人类营养
管辖: 生物医药区

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yaojuan1990: 金币+5, ★有帮助, 谢谢 2014-03-26 20:23:52
yaojuan1990: 金币+5 2014-05-22 16:59:28

整理别人的，希望对你有用！！

PCR引物设计原则
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。让我们先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布最好随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则P1引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。
引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：
① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
② 产物不能形成二级结构。
③ 引物长度一般在15~30碱基之间。
④ G+C含量在40%~60%之间。
⑤ 碱基要随机分布。
⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧ 引物5′端可以修饰。
⑨ 引物3′端不可修饰。
⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位。
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
1.引物的特异性
引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
2.避开产物的二级结构区
某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
3.长度
寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。
4.G+C含量
G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
5.碱基础随机分布
引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
6.引物自身
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。
7.引物之间
两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
8.引物的3′端
引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。
在标准PCR反应体系中，用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dNTP（四种dNTP各200μmol/L）以质粒（103拷贝）为模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下，引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。A∶A错配使产量下降至1/20，A∶G和C∶C错七下降至1/100。引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的。
9.引物的5′端
引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。
10.密码子的简并
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。