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Yocan2012

新虫 (小有名气)

[求助] 植物基因组提取 已有4人参与

最近在做植物基因组提取,用来测序建库使用的。使用的是植物(菊科)的种子作为材料,液氮研磨破碎,CTAB法提取,除了没有使用Tris饱和酚外,其他完全按照CTAB法进行操作。结果见图。此外,有时候提取到的只有250 bp大小的片段,有的时候根本什么也提取不到。但是,在年前做预实验的时候提取的效果是非常好的,20 kb的条带非常好。现在却怎么都重复不出来。求高人指点。
上图为现在的情况,下图为预实验提取的情况,所用maker均为Takara DL15000。

植物基因组提取
未标题-1.jpg


植物基因组提取-1
提取-1.png

[ Last edited by Yocan2012 on 2014-3-18 at 13:18 ]
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花雨sky

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
Yocan2012(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-03-19 16:07:17
用不用tris饱和酚问题不是很大,我没有用也还是提出来了
1、药品有没有问题
2、研磨是否充分,这个很关键,如果研磨不充分的话,就得不到CTAB-核酸复合物,自然就看不到DNA了
3、浸提、抽提等各个步骤的动作一定要温和。
这有个经验总结,希望能对你有帮助http://huanansu211.blog.163.com/ ... 544720105291551541/
5楼2014-03-18 16:38:54
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花雨sky

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by Yocan2012 at 2014-03-18 21:46:02
您的连接已仔细看过,很有帮助。可能离心的过程中温度有点低,不过在加乙醇和乙酸钠之后白色絮状物还是很多的,应该不会是DNA被离心下去了吧。...

不就是要收集沉淀的嘛,我加完乙醇和乙酸钠之后沉淀半个小时,离心收集沉淀,再进行乙醇清洗沉淀。要是你加完之后白色絮状物很多的话就可以直接离心收集沉淀,,不用等半个小时了,这种做法的前提是你的DNA量要多。抽提时候低温,CTAB浸提后离心要上清液的这次离心温度不能低于15度哟。
10楼2014-03-19 18:54:34
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花雨sky

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by Yocan2012 at 2014-03-20 09:27:01
白色沉淀非常多,然后离心,洗涤,加TE溶解。但是上样跑胶后,就是上面那个死样子。不过,nanodrop上面测的核算浓度却能达到几百纳克每微升。...

估计是杂质含量较高,你的材料里富含多糖、多酚吗,可以在CTAB之前,样品研磨完之后用TE-NaCl清洗几次。
12楼2014-03-20 11:30:04
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普通回帖

starseeker

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
Yocan2012(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-19 16:05:12
你的电泳图下方过亮有点看不清楚,但粗略看可能是你提到的DNA降解了,你在提取过程中有没有剧烈的震荡?
2楼2014-03-18 16:00:55
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yipan

铜虫 (职业作家)


【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
Yocan2012(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-19 16:05:31
不要剧烈摇晃,操作应该温和,这样才能最大化的保证DNA的完整性。
3楼2014-03-18 16:14:50
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zhenwuhuang

至尊木虫 (文学泰斗)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
Yocan2012(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-19 16:06:09
植物DNA的提取技术及注意事项
http://chinaaoju.blog.163.com/bl ... 961201211136154169/
4楼2014-03-18 16:33:00
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Yocan2012

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by starseeker at 2014-03-18 16:00:55
你的电泳图下方过亮有点看不清楚,但粗略看可能是你提到的DNA降解了,你在提取过程中有没有剧烈的震荡?

我也认为是降解了。但是操作一直很小心,所以应该不是剧烈震荡的原因。
6楼2014-03-18 17:22:57
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Yocan2012

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by yipan at 2014-03-18 16:14:50
不要剧烈摇晃,操作应该温和,这样才能最大化的保证DNA的完整性。

操作很小心,中间没有剧烈震荡。
7楼2014-03-18 17:23:36
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Yocan2012

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by zhenwuhuang at 2014-03-18 16:33:00
植物DNA的提取技术及注意事项
http://chinaaoju.blog.163.com/blog/static/150088961201211136154169/

您的连接已仔细看过,非常感谢!
8楼2014-03-18 21:43:14
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Yocan2012

新虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 花雨sky at 2014-03-18 16:38:54
用不用tris饱和酚问题不是很大,我没有用也还是提出来了
1、药品有没有问题
2、研磨是否充分,这个很关键,如果研磨不充分的话,就得不到CTAB-核酸复合物,自然就看不到DNA了
3、浸提、抽提等各个步骤的动作一定 ...

您的连接已仔细看过,很有帮助。可能离心的过程中温度有点低,不过在加乙醇和乙酸钠之后白色絮状物还是很多的,应该不会是DNA被离心下去了吧。
9楼2014-03-18 21:46:02
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