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流传着娃娃

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助半干转膜的问题 已有1人参与

最近在做转膜，本人蛋白50kd左右，用的bio-red半干转膜仪，转膜缓冲液用是39mM甘氨酸，48mM Tris，20%甲醇，ＰＶＤＦ膜，严格按照转膜操作进行的，恒压１２Ｖ的话，电流一开始就过小，只有０.０２Ａ，功率直接显示为零，转膜半小时都转不过去。今天试了恒流转，用了０.０３Ａ的电流，电压慢慢上升快超过２５Ｖ，后来改用０.０２Ａ的电流，电压最大的时候达到２２Ｖ。但是染色还是没有条带。预染marker基本上转过去了。将转过后的胶重新染色，胶上很明显的有我的蛋白。求问为什么半干转电流这么低。。。为什么转不过去。。。都转了N次了，伤心，求助！
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1楼 2014-01-02 15:26:20
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
流传着娃娃: 金币+5, ★有帮助 2014-01-07 15:01:15
半干转移的电流本来就很低。与湿法不同，半干转移只有在三明治的地方形成电路，而湿法转移是在整个转移体系里形成电路。我通常用恒流转1小时，转膜电流为三明治的面积（平方厘米）。电压通常是从6V开始，结束时是十几V.
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2楼2014-01-03 04:43:34
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流传着娃娃

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2014-01-03 04:43:34
半干转移的电流本来就很低。与湿法不同，半干转移只有在三明治的地方形成电路，而湿法转移是在整个转移体系里形成电路。我通常用恒流转1小时，转膜电流为三明治的面积（平方厘米）。电压通常是从6V开始，结束时是十 ...

我也用恒流试过了，按照转膜仪说明书，电流为5.5mA每平方厘米，我没敢用这么大，用了不到1/3的电流，电压一开始就有16V，转不到10分钟就超过25V了。。。惆怅啊。。。
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3楼2014-01-03 12:12:55
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 流传着娃娃 at 2014-01-03 12:12:55
我也用恒流试过了，按照转膜仪说明书，电流为5.5mA每平方厘米，我没敢用这么大，用了不到1/3的电流，电压一开始就有16V，转不到10分钟就超过25V了。。。惆怅啊。。。...

不同仪器能提供的电流确实不同。主要是不能发热太多，把仪器烧坏。电压增加是正常的，就像跑普通的电泳一样。如果不是升得非常高（如果是太高可能是体系的buffe不够，干掉了）就没事。这么大的蛋白不存在转过的问题，只要你的仪器允许，转完后没有非常明显的发热就可以的。祝好运。
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4楼2014-01-04 03:47:25
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流传着娃娃

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2014-01-04 03:47:25
不同仪器能提供的电流确实不同。主要是不能发热太多，把仪器烧坏。电压增加是正常的，就像跑普通的电泳一样。如果不是升得非常高（如果是太高可能是体系的buffe不够，干掉了）就没事。这么大的蛋白不存在转过的问题 ...

虽然我还是没有做出来，疑似机器出故障了，不过根据你的解释还是对原理更了解了些，谢谢！准备开始湿转。求好运
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5楼2014-01-07 15:02:13
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