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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » westen blot 染色
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空蓝Y劫

新虫 (小有名气)

[求助] westen blot 染色

最近做western blot 实验结果总是不理想，不出条带。开始时以为是转膜的问题，但染色后的膜在放置一晚上后，染色液蒸发掉了，这个时候在膜上竟然出现条带了！！，

这是怎么个情况呢？？

染色液不知道是什么东西，见上面有 amresco 字样，

膜的话上有Hybond字样，使用前100%甲醇浸泡10s.
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1楼2011-08-12 08:39:28
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w2boluo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
adslye(金币+2): 感谢交流~祝顺利！ 2011-08-12 09:43:49
典型的PVDF膜，这种膜的结合能力较强，杂交背景一般比较深。你用的半干法还是湿法转膜？有没使用预染marker？后者就是阳性对照，一般会标示为prestained
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How about the future？
2楼2011-08-12 09:34:20
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空蓝Y劫

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by w2boluo at 2011-08-12 09:34:20:
典型的PVDF膜，这种膜的结合能力较强，杂交背景一般比较深。你用的半干法还是湿法转膜？有没使用预染marker？后者就是阳性对照，一般会标示为prestained

用的是预染Marker啊，就是跑完SDS-PAGE后不用染色直接就能看到的Marker吧，
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3楼2011-08-12 10:50:34
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空蓝Y劫

新虫 (小有名气)
★ ★
adslye(金币+2): 鼓励新虫交流~祝顺利！ 2011-08-14 09:38:22
应该是湿转，因为用到那个三明治，一黑板，一海绵，一滤纸，一PVDF膜，然后滤纸，海绵，板，这样的，
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4楼2011-08-12 10:52:12
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w2boluo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 空蓝Y劫 at 2011-08-12 10:50:34:
用的是预染Marker啊，就是跑完SDS-PAGE后不用染色直接就能看到的Marker吧，

yes，就是那种，能够看到它转到膜上不？转完了胶上还有没有？这个marker跑不出来，肯定是电泳体系的问题，跑出来了转不上去，那就是电转体系的问题。
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How about the future？
5楼2011-08-12 11:32:23
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w2boluo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
silicare(金币+2): 谢谢参与 2011-08-12 15:44:29
引用回帖:
4楼: Originally posted by 空蓝Y劫 at 2011-08-12 10:52:12:
应该是湿转，因为用到那个三明治，一黑板，一海绵，一滤纸，一PVDF膜，然后滤纸，海绵，板，这样的，

转膜条件是what？整个体系有没有放到冰水里。
可以刚刚转完的时候用丽春红直接染一下看看
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How about the future？
6楼2011-08-12 11:33:40
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空蓝Y劫

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by w2boluo at 2011-08-12 11:33:40:
转膜条件是what？整个体系有没有放到冰水里。
可以刚刚转完的时候用丽春红直接染一下看看

体系整体冰镇，200mA一小时，自我感觉是转膜时间太长了点，顺便问一下，PVDF膜会不会出现转膜转过头，转出膜外的情况？
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7楼2011-08-12 17:11:07
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w2boluo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
lstt09nk(金币+3): 感谢参与 2011-08-12 22:56:59
空蓝Y劫(金币+1): 额，三明治没写全，从下到上，依次是：黑板，海绵，滤纸，胶，膜，滤纸，海绵，白板。这个顺序没问题吧？黑板靠黑面放 2011-08-15 08:51:30
当然有这种情况。但一般来说200ma一小时对湿法也不算太大。不知道你的转膜装置是多大，我以前一直350ma1小时的。pvdf膜极性较强能吸附的蛋白多，很难全部跑到膜外。你的预染marker在哪里？那个是最直接的证据，转不上应该还在胶里，转过头了既不在胶上也不在膜上。还有你上面写的那个三明治，怎么没有看见胶。胶和膜贴合是否紧密没有气泡？
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How about the future？
8楼2011-08-12 22:22:44
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qingyuansw20

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
看天(金币+3): 鼓励回答 2011-08-13 23:38:45
1、根据彩色marker判断跑电泳时是否跑开。marker开了，蛋白自然跑开。
2、转膜要根据PVDF膜上是否有marker条带判断，有就是转上去了。如果转过，会被转到滤纸上。转的不彻底会在胶上游残留。
3、染色是染胶。丽春红染色几个小时，看看就知道了。有带就说明你的蛋白没问题。
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9楼2011-08-13 17:30:42
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qingyuansw20

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
看天(金币+2): 感谢热心 2011-08-13 23:38:57
3、染色是染胶，用卡马斯亮蓝染。丽春红染膜太浪费了，但本人认为不适合染PVDF膜。染纤维膜还行。染色几个小时，看看就知道了。有带就说明你的蛋白没问题。
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10楼2011-08-13 17:36:09
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