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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 请教，镍柱纯化蛋白后，镍柱上的咪唑用除去吗？
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woshiguiren

木虫 (小有名气)

[求助] 请教，镍柱纯化蛋白后，镍柱上的咪唑用除去吗？ 已有4人参与

本人做了一段时间镍柱蛋白纯化的实验，知道咪唑会和蛋白竞争性与镍柱结合，从而使His-tag蛋白从镍柱上脱离。想请教，纯化结束后，结合到镍柱上的咪唑用除去吗？如果用，怎么除去？如果不用，那么对下一次的蛋白挂住有影响吗？（实验所用镍柱为GE公司His-tag镍柱）
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1楼 2013-12-28 22:37:52
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剑客心语

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-29 16:08:00
我一般是用2M的NaCl洗下柱子，用来降低或去除柱子上的咪唑。否者，柱子中的高浓度咪唑会影响蛋白与柱子结合。
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一柄驻剑，一朝旅人，一颗常心，一生志言……行疆漫漫，品味一生……
2楼2013-12-28 23:23:33
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青青子衿1987

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-29 16:08:07
柱子下次再用之前需要先再生，再生的方法:先用含有EDTA的buffer把Ni洗脱下来，再用氢氧化钠浸泡，用略偏碱性的buffer平衡后，在上Ni。既然咪唑是和蛋白竞争才可以把目的蛋白洗脱下来，那么再次和蛋白结合之前，应该还是要再生的。
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3楼2013-12-28 23:44:32
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ljq325

铁杆木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
woshiguiren(kx444555代发): 金币+5, 鼓励交流 2014-01-02 08:33:53
woshiguiren: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-01-06 20:25:00
过完镍柱后，用超纯水冲冲柱子就可以，一般不会影响下次挂镍
这样用过几次后就需要再生，
我们用的步骤是
1.脱镍Buffer（含EDTA）冲洗1-2个柱体积
2.超纯水冲洗3个柱体积
3.用0.5mol/L的NaOH冲洗0.5-1柱体积
4.超纯水冲洗3个柱体积
5.用1M硫酸铜挂镍
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4楼2014-01-01 22:40:44
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johnny4890

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 青青子衿1987 at 2013-12-28 23:44:32
柱子下次再用之前需要先再生，再生的方法:先用含有EDTA的buffer把Ni洗脱下来，再用氢氧化钠浸泡，用略偏碱性的buffer平衡后，在上Ni。既然咪唑是和蛋白竞争才可以把目的蛋白洗脱下来，那么再次和蛋白结合之前，应该 ...

这个方法会害死人的，不要随便再生。再生有风险，谨慎。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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5楼2014-03-09 01:02:29
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青青子衿1987

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by johnny4890 at 2014-03-09 01:02:29
这个方法会害死人的，不要随便再生。再生有风险，谨慎。
...

为什么啊，我们组一直用的这种方法再生镍柱啊，求解释啊！
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6楼2014-03-10 18:27:51
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johnny4890

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 青青子衿1987 at 2014-03-10 18:27:51
为什么啊，我们组一直用的这种方法再生镍柱啊，求解释啊！...

说明书上都写了，只有当镍流失的时候才考虑重挂。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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7楼2014-03-10 22:56:56
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