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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Western blot目的条带显影后怎么会这样？？？看图片
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c_yl

银虫 (初入文坛)

[求助] Western blot目的条带显影后怎么会这样？？？看图片 已有4人参与

目的条带显出来不应该是一条吗？我的为什么会是这样？一抗 1:1000，二抗1：1万
内参的结果也不太正常，为什么条带是中空的？？
求高手指点！！谢谢！！
Western blot目的条带显影后怎么会这样？？？看图片
目的条带.jpg


Western blot目的条带显影后怎么会这样？？？看图片-1
内参.jpg
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1楼 2013-12-21 16:31:22
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15879003030

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-12-21 22:03:31
一抗没有特异性？

内参估计是因为转膜的时候有汽泡
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2楼2013-12-21 20:12:32
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stevenshi021

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-12-21 22:03:45
c_yl: 金币+10, ★有帮助 2014-01-04 13:28:36
感觉是你没有封闭好，两张片子。一般封闭如果不要抽滤装备至少一个小时。此外，如果使用AP底物，建议不适用PBS改用Tris的buffer。置于条带中间空的是因为你的上样量太多，哪里集中了大量抗原经过WB的级联反应最终使得哪里的螯合于二抗的显色的酶比较多，在短时间内消耗了所有的底物，因此哪里没有荧光造成中间空白。
希望对你有用。
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3楼2013-12-21 21:51:45
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stevenshi021

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

此外，一抗浓度也同样较高，一般在5000-10000就行！
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4楼2013-12-21 21:52:38
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c_yl

银虫 (初入文坛)
内容已删除
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5楼2013-12-21 21:58:33
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c_yl

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by stevenshi021 at 2013-12-21 21:51:45
感觉是你没有封闭好，两张片子。一般封闭如果不要抽滤装备至少一个小时。此外，如果使用AP底物，建议不适用PBS改用Tris的buffer。置于条带中间空的是因为你的上样量太多，哪里集中了大量抗原经过WB的级联反应最终使 ...

我用的封闭液是5%的BSA+20ml TBST，封闭两小时,以前做其他蛋白用脱脂奶粉封闭，BSA和脱脂奶粉哪个好一些呢？
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6楼2013-12-21 22:10:58
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tsyxy421

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-22 01:35:09
第一张图，可以采用多压几张片子，找最好的那张分析。第二章中空是显影的问题，不是转膜的问题。
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沉稳扎实，勤奋刻苦。
7楼2013-12-21 23:52:37
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hl16010921

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是加完底物特别亮，过段时间就暗了？原因如3楼，二抗结合的量太大了，底物消耗过快，压片时表达量大的反而出现空心或条带浅。一般降低二抗浓度或增强封闭。一般奶粉的蛋白种类多些相当于多种蛋白混合封闭，BSA的蛋白比较单一且较贵。我一般倾向用奶粉（便宜呀）。
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8楼2013-12-23 08:51:58
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wangxueflower

木虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by c_yl at 2013-12-21 22:10:58
我用的封闭液是5%的BSA+20ml TBST，封闭两小时,以前做其他蛋白用脱脂奶粉封闭，BSA和脱脂奶粉哪个好一些呢？...

一般BSA比脱脂奶粉要好一些，相对的价格也会搞一些
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花开花落，云卷云舒
9楼2014-06-13 10:08:27
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