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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光定量PCR如何进行绝对定量？
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冰雪灵魂

木虫 (著名写手)

食品科学家族族长

[求助] 荧光定量PCR如何进行绝对定量？ 已有2人参与

real-time PCR 分绝对定量和相对定量，我做的是绝对定量。绝对定量需要绘制标准曲线  标曲的恒坐标是基因拷贝数的对数值 纵坐标是CT值。
问题一：跑样品得到CT值后  如何从基因浓度换算回活菌数。（我做的是要这种PCR测定干酪样品中双歧杆菌的活菌数）
问题二：用标准品做标准曲线。我的标准品就是纯培养的双歧杆菌吗？从菌体中提取DNA ?
问题三：在四楼人做的都是提rna,我看文献中写的都是提DNA，还有文献提的是将目的基因转到大肠菌的质粒中   然后再提质粒，有什么区别？
问题四：需要特异性引物或者探针，如何设计？
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要想得到常人所不能得到的，就懂得付出常人所不能付出的！
1楼 2013-12-11 20:09:52
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Mp2.0

新虫 (小有名气)
请问，标准品是买的还是自己做出来的啊？已知浓度自己用仪器测出来的算吗？

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4楼2019-11-27 10:31:11
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宇宙小妖怪

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

绝对定量是用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量，绝对定量不同于相对定量，我们是验室用BIOG KIT做PCR实验检测目标RNA，做下来CT值在28左右，S型曲线比较典型
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2楼2019-03-25 08:51:25
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粒粒粥呀

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

首先你需要构建准备标准品，目前我所遇到的标准品都是构建了含目的基因的质粒；
质粒测浓度后可以根据公式换算成拷贝数（公式不太好贴，自行百度）；
标准品10倍倍比稀释后检测，根据不同稀释度对应的拷贝数和得到的CT值得出标准曲线对应的公式；
将待检样品的CT值带入公式就可以得出样品所含的拷贝数；
活菌数什么的我就不太懂了
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3楼2019-03-26 18:04:03
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Mp2.0

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 宇宙小妖怪 at 2019-03-25 08:51:25
绝对定量是用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量，绝对定量不同于相对定量，我们是验室用BIOG KIT做PCR实验检测目标RNA，做下来CT值在28左右，S型曲线比较典型

请问，标准品是买的还是自己做出来的啊？已知浓度自己用仪器测出来的算吗？

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5楼2019-11-27 10:32:27
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