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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 共聚焦显微镜-GFP液泡膜定位问题
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七八月的阳光

铜虫 (初入文坛)

[求助] 共聚焦显微镜-GFP液泡膜定位问题 已有1人参与

目前在做蛋白亚细胞定位，连的GFP，用的拟南芥原生质体转化，在共聚焦显微镜下观察。

如图中的观察结果，有些质粒看不到明显的GFP荧光，但是有一些与叶绿体背景相当，或者稍强于叶绿体背景的环状荧光信号。请问这些是转化的质粒的GFP信号吗。做了很多质粒，golgi、TGN等的信号都还不错，但至今没有得到质粒的液泡膜信号。有些质粒是已被验证过的液泡膜定位，但在我的实验中也没有观察到强的GFP信号，最多就是图片中的强度。请问，图片中的环状信号是背景，还是我的质粒的信号呢。
共聚焦显微镜-GFP液泡膜定位问题
9-5.jpg


共聚焦显微镜-GFP液泡膜定位问题-1
7-2.jpg


共聚焦显微镜-GFP液泡膜定位问题-2
7-7-2.jpg


共聚焦显微镜-GFP液泡膜定位问题-3
9-1.jpg
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1楼 2013-11-12 12:03:09
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
七八月的阳光: 金币+1, ★有帮助 2013-11-12 18:00:11
最好找更典型的照片，不过我感觉是在液泡上表达的，譬如9-1的右上角。另外，可以找一些液泡标记蛋白作个对照。
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2楼2013-11-12 17:33:39
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七八月的阳光

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by starseacow at 2013-11-12 17:33:39
最好找更典型的照片，不过我感觉是在液泡上表达的，譬如9-1的右上角。另外，可以找一些液泡标记蛋白作个对照。

如果就这样的荧光强度，能够和液泡膜的marker重叠，就能证明是定位在液泡膜吗？
我做的其他定位在golgi等的质粒，GFP荧光就特别强，完全可以忽略叶绿体的背景，不知道为什么做液泡膜的就得不到强的荧光？
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3楼2013-11-12 18:04:47
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starseacow

专家顾问 (职业作家)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-12 19:13:47
引用回帖:
3楼: Originally posted by 七八月的阳光 at 2013-11-12 18:04:47
如果就这样的荧光强度，能够和液泡膜的marker重叠，就能证明是定位在液泡膜吗？
我做的其他定位在golgi等的质粒，GFP荧光就特别强，完全可以忽略叶绿体的背景，不知道为什么做液泡膜的就得不到强的荧光？...

一方面，和marker重叠，另一方面，最好找比较典型的细胞，譬如上面我提到的9-1，这样的结果基本上就可以说明问题了，如果条件允许，最好再做个western blot验证蛋白表达。荧光强度不强，如果排除实验步骤问题，这可能和你所标记的蛋白性质有关。
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4楼2013-11-12 18:41:17
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七八月的阳光

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by starseacow at 2013-11-12 18:41:17
一方面，和marker重叠，另一方面，最好找比较典型的细胞，譬如上面我提到的9-1，这样的结果基本上就可以说明问题了，如果条件允许，最好再做个western blot验证蛋白表达。荧光强度不强，如果排除实验步骤问题，这可 ...

western是用转化后的原生质体来做吗
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5楼2013-11-13 10:15:50
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starseacow

专家顾问 (职业作家)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 七八月的阳光 at 2013-11-13 10:15:50
western是用转化后的原生质体来做吗...

是的
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6楼2013-11-13 17:10:01
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sun_in_night

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-14 23:02:08
不应该呀，叶绿体的自发荧光都在650以上了，而一般GFP的波长在500上下，你怎么能检测到？难道你的收集光区有这么大？
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7楼2013-11-13 23:20:28
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dfl204

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

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叶绿体的自发荧光可以设置成其它的颜色。另外建议使用已知蛋白Marker-RFP进行共转。
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8楼2013-11-14 15:45:29
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Njau-123

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by dfl204 at 2013-11-14 15:45:29
叶绿体的自发荧光可以设置成其它的颜色。另外建议使用已知蛋白Marker-RFP进行共转。

叶绿体自发荧光怎么去除，
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9楼2018-05-07 20:13:54
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