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七八月的阳光

铜虫 (初入文坛)

[求助] 共聚焦显微镜-GFP液泡膜定位问题 已有1人参与

目前在做蛋白亚细胞定位,连的GFP,用的拟南芥原生质体转化,在共聚焦显微镜下观察。

如图中的观察结果,有些质粒看不到明显的GFP荧光,但是有一些与叶绿体背景相当,或者稍强于叶绿体背景的环状荧光信号。请问这些是转化的质粒的GFP信号吗。做了很多质粒,golgi、TGN等的信号都还不错,但至今没有得到质粒的液泡膜信号。有些质粒是已被验证过的液泡膜定位,但在我的实验中也没有观察到强的GFP信号,最多就是图片中的强度。请问,图片中的环状信号是背景,还是我的质粒的信号呢。
共聚焦显微镜-GFP液泡膜定位问题
9-5.jpg


共聚焦显微镜-GFP液泡膜定位问题-1
7-2.jpg


共聚焦显微镜-GFP液泡膜定位问题-2
7-7-2.jpg


共聚焦显微镜-GFP液泡膜定位问题-3
9-1.jpg
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starseacow

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★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-12 19:13:47
引用回帖:
3楼: Originally posted by 七八月的阳光 at 2013-11-12 18:04:47
如果就这样的荧光强度,能够和液泡膜的marker重叠,就能证明是定位在液泡膜吗?
我做的其他定位在golgi等的质粒,GFP荧光就特别强,完全可以忽略叶绿体的背景,不知道为什么做液泡膜的就得不到强的荧光?...

一方面,和marker重叠,另一方面,最好找比较典型的细胞,譬如上面我提到的9-1,这样的结果基本上就可以说明问题了,如果条件允许,最好再做个western blot验证蛋白表达。荧光强度不强,如果排除实验步骤问题,这可能和你所标记的蛋白性质有关。
植物生理群69993869,为避免广告,申请加入请提供木虫昵称,院校及专业信息
4楼2013-11-12 18:41:17
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
七八月的阳光: 金币+1, 有帮助 2013-11-12 18:00:11
最好找更典型的照片,不过我感觉是在液泡上表达的,譬如9-1的右上角。另外,可以找一些液泡标记蛋白作个对照。
植物生理群69993869,为避免广告,申请加入请提供木虫昵称,院校及专业信息
2楼2013-11-12 17:33:39
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七八月的阳光

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by starseacow at 2013-11-12 17:33:39
最好找更典型的照片,不过我感觉是在液泡上表达的,譬如9-1的右上角。另外,可以找一些液泡标记蛋白作个对照。

如果就这样的荧光强度,能够和液泡膜的marker重叠,就能证明是定位在液泡膜吗?
我做的其他定位在golgi等的质粒,GFP荧光就特别强,完全可以忽略叶绿体的背景,不知道为什么做液泡膜的就得不到强的荧光?
3楼2013-11-12 18:04:47
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七八月的阳光

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by starseacow at 2013-11-12 18:41:17
一方面,和marker重叠,另一方面,最好找比较典型的细胞,譬如上面我提到的9-1,这样的结果基本上就可以说明问题了,如果条件允许,最好再做个western blot验证蛋白表达。荧光强度不强,如果排除实验步骤问题,这可 ...

western是用转化后的原生质体来做吗
5楼2013-11-13 10:15:50
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