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笑笑2697

铁虫 (小有名气)

[求助] 蛋白纯化交流

最近在纯化一分子量为10k的小蛋白，但是50mM咪唑就洗下了好多目的蛋白，这种情况应该怎么改变纯化条件呢？
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1楼 2013-11-10 15:15:39
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Lovebirdshs

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-10 23:00:53
这个蛋白也太小了点，一般是先用适当体积不含咪唑或者是低浓度如20mM咪唑的wash Buffer洗脱杂蛋白，然后再用高浓度的，梯度浓度50-75-100-150-300，当然任何蛋白都有一个自己最适合的洗脱浓度，这个需要预实验摸索的
慢慢来，祝早日纯化成功
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孤独的舞者
2楼2013-11-10 20:07:07
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
咪唑洗脱只能调节咪唑的浓度，总会有损失，目的蛋白表达量明显是纯化的前提条件。
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3楼2013-11-11 15:28:17
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haojunfeng87

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
洗脱的时候先用不含咪唑的buffer,然后再依次提高咪唑的浓度，摸索一下吧，祝成功。
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4楼2013-11-12 12:06:51
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dongmings

木虫之王 (文学泰斗)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用的是亲和柱吗，没试试别的柱子？
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5楼2013-11-12 14:47:45
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笑笑2697

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by dongmings at 2013-11-12 14:47:45
用的是亲和柱吗，没试试别的柱子？

没有，就这一种柱子
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6楼2013-11-12 19:25:34
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果果isj

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我之前有用超滤管直接离心纯化的，没有用任何试剂，最多用些蛋白的溶剂吧（我的是可溶性蛋白，只用水）。超滤管是5kd的规格，应该可以的吧。但是大于5kd的也会留下来，不知道对你的有没有影响。
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7楼2013-11-13 11:02:12
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gaolei0529

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以考虑使用pH梯度洗脱，另外His的特异性不好，纯度估计比较麻烦，你纯化的目的是什么？可以考虑离子柱或者反相。
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8楼2013-11-13 15:14:50
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