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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 血清蛋白western上样内参
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lgs1

木虫 (小有名气)

[求助] 血清蛋白western上样内参

最近需要做几个血清蛋白的western验证实验，由于没有内参，所以采用丽春红染色作为上样内参，但是重复做了好几次染出来的条带深浅都不是很一致，查了好几篇文献都只是在文中提了一句用丽春红作上样内参，没有说具体的判断方法，不知道是用的肉眼还是灰度扫描，而且有的时候文献里面两条染色明显有差异的条带也拿出来做内参，让人感觉很疑惑，希望大家能够指点一下丽春红染色作内参的注意事项，谢谢。下图是我染色后的pvdf膜
血清蛋白western上样内参
TM截图未命名.jpg
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1楼2013-11-03 15:52:44
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yanshuai511

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-07 22:23:03
血清的western定量，一个是确保上样的血清体积是一样的，另外就是用Albumin做内参，如果你的实验不影响albumin表达的话。
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7楼2013-11-06 20:39:21
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lgs1: 金币+4, ★★★很有帮助 2013-11-04 13:29:24
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-11-04 14:07:28
没有做过你的样品。用丽春红染膜只要是看大量表达蛋白的情况。常用的内参的表达量也是很高的。所以可以看主要带是否灰度相同。但是由于样品的处理不同，有时候会造成某些大量表达蛋白的变化，但总有一些蛋白的表达还是不变你。你可以选择不受样品处理影响的蛋白做内参。
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2楼2013-11-04 01:34:13
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lgs1

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-04 01:34:13
没有做过你的样品。用丽春红染膜只要是看大量表达蛋白的情况。常用的内参的表达量也是很高的。所以可以看主要带是否灰度相同。但是由于样品的处理不同，有时候会造成某些大量表达蛋白的变化，但总有一些蛋白的表达还 ...

但是丽春红染色不是应该和全蛋白反应吗，扫描灰度的时候是不是应该整个泳道都扫下来呢，另外我的一个目的蛋白是70kd，和血清里面的高丰度蛋白很接近，所以样品都是去过高丰度的，这样是不是就没有蛋白能够作为内参了呢？谢谢
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3楼2013-11-04 13:34:23
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-05 11:46:45
引用回帖:
3楼: Originally posted by lgs1 at 2013-11-04 13:34:23
但是丽春红染色不是应该和全蛋白反应吗，扫描灰度的时候是不是应该整个泳道都扫下来呢，另外我的一个目的蛋白是70kd，和血清里面的高丰度蛋白很接近，所以样品都是去过高丰度的，这样是不是就没有蛋白能够作为内参 ...

丽春红染色不灵敏，只能看到丰度比较高的蛋白条带，而也正是这些丰度高的蛋白决定了总蛋白的多少。一般跑胶时也是按照上相同量总蛋白做的。因为你的样品是去掉高丰度蛋白的，所以你需要做内参。因为去高丰度蛋白时会很大程度上影响总蛋白，而且丽春红染色后也不容易判断是否上样量相同。
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4楼2013-11-04 15:35:56
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