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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 已经得到目的基因的全长，现在要PCR将目的基因全长P出来，如何设计引物？谢谢
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君扬1989

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] 已经得到目的基因的全长，现在要PCR将目的基因全长P出来，如何设计引物？谢谢

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1楼2013-10-31 11:11:48
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君扬1989

铁杆木虫 (著名写手)
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3楼: Originally posted by qfzhang at 2013-10-31 13:17:40
有很多引物设计软件的。简单易用，只要掌握引物设计的基本原则，然后再用相关软件来设计，很容易的。

现在我的引物酶切位点含有Nde I，我要用什么没代替呢？
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4楼2013-11-01 18:47:22
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君扬1989

铁杆木虫 (著名写手)
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2楼: Originally posted by myprayer at 2013-10-31 12:22:58
标准的PCR操作程序是将各种所需反应成分分别加入PCR反应管中，然后根据具体的实验要求，设置一定的循环参数，进行循环扩增。具体如下：

(1) 向PCR反应管中依次加入

DNA模板 50～300ng (约为102～105拷贝DNA ...

现在我的引物酶切位点含有Nde I，我要用什么没代替呢？
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5楼2013-11-01 18:47:51
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君扬1989

铁杆木虫 (著名写手)
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7楼: Originally posted by wilzu at 2013-11-02 00:48:56
那要看你准备把基因克隆到哪个载体 尽量选择载体上是单一的酶而在基因内部是没有的酶 建议在引物设计时上下游引物设计不同的酶切位点 因为如果是单一酶切克隆的话 你要考虑方向性的问题（除非基因方向没有关系）
...

pet30a载体，本来想设计ned I 酶切位点，但目的条带本身就含有这个酶切位点，我不知道要用哪个酶切位点来代替它比较合适？
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8楼2013-11-02 08:34:38
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君扬1989

铁杆木虫 (著名写手)
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9楼: Originally posted by wilzu at 2013-11-02 09:11:35
你可以选择多克隆位点去的任意其他酶。这样的话，表达的蛋白N端或带上histag和stag。这两个tag不大，也方便你后期蛋白的纯化。
比如5'端选择NcoI, 因为它的酶切位点是ccatgg,为了保证不移码，你设计的引物的时候可 ...

非常感谢！
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10楼2013-11-04 10:13:09
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君扬1989

铁杆木虫 (著名写手)
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11楼: Originally posted by mm551552 at 2014-04-25 15:30:47
现在做出来了吗？分享一下

我不知道你是要做哪部工作？我做的是蛋白表达，以我为例，以PET30a为载体，先找到起始密码子和终止密码子。以他们来设计引物并在前后两外端加上两个合适的酶切位点。
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12楼2014-04-28 16:33:27
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