24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
查看: 5328  |  回复: 12
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

1970-01-01 08:00:00
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

智能机器人

Robot (super robot)

我们都爱小木虫

wilzu

木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-02 02:06:27
君扬1989: 金币+2 2013-11-02 08:31:17
引用回帖:
5楼: Originally posted by 君扬1989 at 2013-11-01 18:47:51
现在我的引物酶切位点含有Nde I,我要用什么没代替呢?...

那要看你准备把基因克隆到哪个载体 尽量选择载体上是单一的酶而在基因内部是没有的酶 建议在引物设计时上下游引物设计不同的酶切位点 因为如果是单一酶切克隆的话 你要考虑方向性的问题(除非基因方向没有关系)

[ 发自小木虫客户端 ]
7楼2013-11-02 00:48:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答

myprayer

专家顾问 (著名写手)

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+5, 鼓励交流!my版热心 2013-10-31 13:05:13
君扬1989: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-11-01 18:45:05
标准的PCR操作程序是将各种所需反应成分分别加入PCR反应管中,然后根据具体的实验要求,设置一定的循环参数,进行循环扩增。具体如下:

(1) 向PCR反应管中依次加入

DNA模板 50~300ng (约为102~105拷贝DNA)

引物(3'→5',5'→3')各 2μl 10μmol/L (终浓度为0.4μmol/L)

dNTP 2μl 5mmol/L (终浓度为0.2μmol/L)

10×PCR缓冲液 5μl 1/10体积 (终浓度为1×)

MgCl2 3μl 25mmol/L (终浓度为1.5mmol/L)
注意的地方:
1. 引物的质量是保证PCR特异性的关键,引物过长或过短均会使特异性降低,以18~30bp为宜;引物中C+G含量宜在50%左右;引物内部和引物之间不应含有互补序列;引物的碱基顺序与非扩增区域的同源性应小于70%;引物的3’末端与模板DNA一定要配对,但末端没有严格的限制,故引物设计时可在5’末端加上限制性内切酶位点和/或启动密码ATG等;引物合成后必须纯化以去除合成产物中的不完整序列、脱嘌呤产物、碱基修饰链等“杂质”;引物的终浓度一般为0.2~0.5μmol/L,过低会影响反应产量,过高会增加引物二聚或错配的几率。
2楼2013-10-31 12:22:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qfzhang

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-10-31 13:27:22
君扬1989: 金币+2 2013-11-01 18:48:07
有很多引物设计软件的。简单易用,只要掌握引物设计的基本原则,然后再用相关软件来设计,很容易的。
3楼2013-10-31 13:17:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

君扬1989

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by qfzhang at 2013-10-31 13:17:40
有很多引物设计软件的。简单易用,只要掌握引物设计的基本原则,然后再用相关软件来设计,很容易的。

现在我的引物酶切位点含有Nde I,我要用什么没代替呢?
4楼2013-11-01 18:47:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
信息提示
请填处理意见