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君扬1989铁杆木虫 (著名写手)
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已经得到目的基因的全长，现在要PCR将目的基因全长P出来，如何设计引物？谢谢
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标准的PCR操作程序是将各种所需反应成分分别加入PCR反应管中，然后根据具体的实验要求，设置一定的循环参数，进行循环扩增。具体如下： (1) 向PCR反应管中依次加入 DNA模板 50～300ng (约为102～105拷贝DNA) 引物(3'→5'，5'→3')各 2μl 10μmol/L (终浓度为0.4μmol/L) dNTP 2μl 5mmol/L (终浓度为0.2μmol/L) 10×PCR缓冲液 5μl 1/10体积 (终浓度为1×) MgCl2 3μl 25mmol/L (终浓度为1.5mmol/L) 注意的地方： 1. 引物的质量是保证PCR特异性的关键，引物过长或过短均会使特异性降低，以18～30bp为宜；引物中C+G含量宜在50%左右；引物内部和引物之间不应含有互补序列；引物的碱基顺序与非扩增区域的同源性应小于70%；引物的3’末端与模板DNA一定要配对，但末端没有严格的限制，故引物设计时可在5’末端加上限制性内切酶位点和/或启动密码ATG等；引物合成后必须纯化以去除合成产物中的不完整序列、脱嘌呤产物、碱基修饰链等“杂质”；引物的终浓度一般为0.2～0.5μmol/L，过低会影响反应产量，过高会增加引物二聚或错配的几率。 |
2楼2013-10-31 12:22:58
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