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楼1970-01-01 08:00:00
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君扬1989

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by qfzhang at 2013-10-31 13:17:40
有很多引物设计软件的。简单易用，只要掌握引物设计的基本原则，然后再用相关软件来设计，很容易的。

现在我的引物酶切位点含有Nde I，我要用什么没代替呢？
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4楼2013-11-01 18:47:22
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myprayer

专家顾问 (著名写手)

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+5, 鼓励交流！my版热心 2013-10-31 13:05:13
君扬1989: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-11-01 18:45:05
标准的PCR操作程序是将各种所需反应成分分别加入PCR反应管中，然后根据具体的实验要求，设置一定的循环参数，进行循环扩增。具体如下：

(1) 向PCR反应管中依次加入

DNA模板 50～300ng (约为102～105拷贝DNA)

引物(3'→5'，5'→3')各 2μl 10μmol/L (终浓度为0.4μmol/L)

dNTP 2μl 5mmol/L (终浓度为0.2μmol/L)

10×PCR缓冲液 5μl 1/10体积 (终浓度为1×)

MgCl2 3μl 25mmol/L (终浓度为1.5mmol/L)
注意的地方：
1. 引物的质量是保证PCR特异性的关键，引物过长或过短均会使特异性降低，以18～30bp为宜；引物中C+G含量宜在50%左右；引物内部和引物之间不应含有互补序列；引物的碱基顺序与非扩增区域的同源性应小于70%；引物的3’末端与模板DNA一定要配对，但末端没有严格的限制，故引物设计时可在5’末端加上限制性内切酶位点和/或启动密码ATG等；引物合成后必须纯化以去除合成产物中的不完整序列、脱嘌呤产物、碱基修饰链等“杂质”；引物的终浓度一般为0.2～0.5μmol/L，过低会影响反应产量，过高会增加引物二聚或错配的几率。
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2楼2013-10-31 12:22:58
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qfzhang

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-10-31 13:27:22
君扬1989: 金币+2 2013-11-01 18:48:07
有很多引物设计软件的。简单易用，只要掌握引物设计的基本原则，然后再用相关软件来设计，很容易的。
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3楼2013-10-31 13:17:40
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君扬1989

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by myprayer at 2013-10-31 12:22:58
标准的PCR操作程序是将各种所需反应成分分别加入PCR反应管中，然后根据具体的实验要求，设置一定的循环参数，进行循环扩增。具体如下：

(1) 向PCR反应管中依次加入

DNA模板 50～300ng (约为102～105拷贝DNA ...

现在我的引物酶切位点含有Nde I，我要用什么没代替呢？
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5楼2013-11-01 18:47:51
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