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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 已经得到目的基因的全长，现在要PCR将目的基因全长P出来，如何设计引物？谢谢
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楼1970-01-01 08:00:00
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wilzu

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【答案】应助回帖

★
君扬1989: 金币+1 2013-11-02 10:28:43
引用回帖:
8楼: Originally posted by 君扬1989 at 2013-11-02 08:34:38
pet30a载体，本来想设计ned I 酶切位点，但目的条带本身就含有这个酶切位点，我不知道要用哪个酶切位点来代替它比较合适？...

你可以选择多克隆位点去的任意其他酶。这样的话，表达的蛋白N端或带上histag和stag。这两个tag不大，也方便你后期蛋白的纯化。
比如5'端选择NcoI, 因为它的酶切位点是ccatgg,为了保证不移码，你设计的引物的时候可以为ccatgggc+你的蛋白基因。
或者选择其他酶，因为表达时候是从ndeI的atg开始翻译的，切记要注意移码的问题。
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9楼2013-11-02 09:11:35
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myprayer

专家顾问 (著名写手)

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+5, 鼓励交流！my版热心 2013-10-31 13:05:13
君扬1989: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-11-01 18:45:05
标准的PCR操作程序是将各种所需反应成分分别加入PCR反应管中，然后根据具体的实验要求，设置一定的循环参数，进行循环扩增。具体如下：

(1) 向PCR反应管中依次加入

DNA模板 50～300ng (约为102～105拷贝DNA)

引物(3'→5'，5'→3')各 2μl 10μmol/L (终浓度为0.4μmol/L)

dNTP 2μl 5mmol/L (终浓度为0.2μmol/L)

10×PCR缓冲液 5μl 1/10体积 (终浓度为1×)

MgCl2 3μl 25mmol/L (终浓度为1.5mmol/L)
注意的地方：
1. 引物的质量是保证PCR特异性的关键，引物过长或过短均会使特异性降低，以18～30bp为宜；引物中C+G含量宜在50%左右；引物内部和引物之间不应含有互补序列；引物的碱基顺序与非扩增区域的同源性应小于70%；引物的3’末端与模板DNA一定要配对，但末端没有严格的限制，故引物设计时可在5’末端加上限制性内切酶位点和/或启动密码ATG等；引物合成后必须纯化以去除合成产物中的不完整序列、脱嘌呤产物、碱基修饰链等“杂质”；引物的终浓度一般为0.2～0.5μmol/L，过低会影响反应产量，过高会增加引物二聚或错配的几率。
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2楼2013-10-31 12:22:58
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qfzhang

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-10-31 13:27:22
君扬1989: 金币+2 2013-11-01 18:48:07
有很多引物设计软件的。简单易用，只要掌握引物设计的基本原则，然后再用相关软件来设计，很容易的。
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3楼2013-10-31 13:17:40
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君扬1989

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by qfzhang at 2013-10-31 13:17:40
有很多引物设计软件的。简单易用，只要掌握引物设计的基本原则，然后再用相关软件来设计，很容易的。

现在我的引物酶切位点含有Nde I，我要用什么没代替呢？
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4楼2013-11-01 18:47:22
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