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yangyan_cwnu

新虫 (初入文坛)

[交流] 如何设计一个PCR体系 已有3人参与

求助，如何设计一个PCR体系?
我现在扩增ACC1基因，大概1500kb，采用2*mix扩增，但扩增效果始终不好，无法进行下游实验，请高手指点。谢谢
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1楼 2013-10-22 09:27:45
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yangyan_cwnu

新虫 (初入文坛)
补充：扩增程序：预变性：4min，94度。35个循环：变性，30s，94度；变性：30s，56度；退火：30s，56度；延伸：4min，68度。然后，68度，延伸15min。
现用扩增程序：2*mix：10微升。DDW：6微升。P1：1微升。P2：1微升。DNA：2微升。
效果不理想，求助各位大侠，各位高手。谢谢了！
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2楼2013-10-22 09:52:30
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nwsuafliu

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引物终浓度控制在0.2-0.5 uM
模板DNA最好能测一下浓度，控制在100 ng之内
延伸温度可用72度
最好能设梯度，找最佳退火温度。
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知识改变命运
3楼2013-10-23 23:28:47
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wwzjlq

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你的片段大小是不是太长了？

[ 发自小木虫客户端 ]
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向阳生长……
4楼2013-10-24 12:57:29
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xy656691

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
2楼: Originally posted by yangyan_cwnu at 2013-10-22 09:52:30
补充：扩增程序：预变性：4min，94度。35个循环：变性，30s，94度；变性：30s，56度；退火：30s，56度；延伸：4min，68度。然后，68度，延伸15min。
现用扩增程序：2*mix：10微升。DDW：6微升。P1：1微升。P2：1微 ...

延伸没必要4min，mix里面的taq酶起码1Min能延伸1KB。延伸温度的话taq酶是72度，KOD酶才是68度。楼主再具体说下扩增效果不好是怎么不好？最好把PCR产物跑胶的图片发上来看看
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5楼2013-10-24 22:09:47
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