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yangyan_cwnu

新虫 (初入文坛)

[交流] 如何设计一个PCR体系 已有3人参与

求助,如何设计一个PCR体系?
我现在扩增ACC1基因,大概1500kb,采用2*mix扩增,但扩增效果始终不好,无法进行下游实验,请高手指点。谢谢
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yangyan_cwnu

新虫 (初入文坛)

补充:扩增程序:预变性:4min,94度。35个循环:变性,30s,94度;变性:30s,56度;退火:30s,56度;延伸:4min,68度。然后,68度,延伸15min。
现用扩增程序:2*mix:10微升。DDW:6微升。P1:1微升。P2:1微升。DNA:2微升。
效果不理想,求助各位大侠,各位高手。谢谢了!
2楼2013-10-22 09:52:30
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nwsuafliu

木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引物终浓度控制在0.2-0.5 uM
模板DNA最好能测一下浓度,控制在100 ng之内
延伸温度可用72度
最好能设梯度,找最佳退火温度。
知识改变命运
3楼2013-10-23 23:28:47
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wwzjlq

银虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你的片段大小是不是太长了?

[ 发自小木虫客户端 ]
向阳生长……
4楼2013-10-24 12:57:29
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xy656691

金虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
2楼: Originally posted by yangyan_cwnu at 2013-10-22 09:52:30
补充:扩增程序:预变性:4min,94度。35个循环:变性,30s,94度;变性:30s,56度;退火:30s,56度;延伸:4min,68度。然后,68度,延伸15min。
现用扩增程序:2*mix:10微升。DDW:6微升。P1:1微升。P2:1微 ...

延伸没必要4min,mix里面的taq酶起码1Min能延伸1KB。延伸温度的话taq酶是72度,KOD酶才是68度。楼主再具体说下扩增效果不好是怎么不好?最好把PCR产物跑胶的图片发上来看看
5楼2013-10-24 22:09:47
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