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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶活求助啊！！！！！
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风吹我已散

木虫 (正式写手)

[求助] 酶活求助啊！！！！！

各位，求救!!!!!!!!!
我是要测一个在大肠杆菌里面异源表达的一个蛋白的酶活，这个酶原则上来说，可以催化A和B生成C和D，反应是不可逆的。然后我就摇菌，IPTG诱导，超声破碎（PBS缓冲液+BSA+10%甘油）提蛋白，然后分光光度计测底物A的变化。变化是有了，可是负对照（不加IPTG诱导）也有变化啊（底物A的吸收值下降的程度和我加IPTG诱导后蛋白提取物的结果差不多）。然后我怀疑是不是我的这个转化后的大肠杆菌可以表达微量的目的蛋白，这微量的蛋白足以催化我的反应？
于是我把蛋白换成是蛋白提取液（PBS缓冲液+BSA+10%甘油），再加两个底物A和B，结果，悲催了，分光光度计显示的变化和之前的实验结果一样！！！！！！！！！！
酶活实验步骤：1，空白对照（Tris+双蒸水+蛋白粗提物+BSA), Measure Blank
                         2，Tris+双蒸水+BSA+底物A, Measure Sample(底物A在A 300nm有最大吸收峰）
                         3， 加蛋白粗提物，Measure Sample
                         4，加底物B，Measure Sample（所有实验在此时，A 300nm下降剧烈，吸收值约变为之前的1/4）。不知道是什么原因，我原本想着可能是目的蛋白在大肠杆菌里面的微量表达也注意催化我的反应；可是不加蛋白，将试验中加蛋白的步骤换成是蛋白提取液（PBS缓冲液+BSA+10%甘油）， 分光光度计显示的结果也基本一样，到底是什么原因呢？是BSA的干扰么？还是？？？？？？
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1楼 2013-10-18 19:40:33
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风吹我已散

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-10-19 14:50:13
我个人认为可能原因如下：
1.可能是蛋白提取液（PBS缓冲液+BSA+10%甘油）中的酶蛋白的折叠形态与酶蛋白的标准品不一样。导致蛋白提取液（PBS缓冲液+BSA+10%甘油）中的酶蛋白至少在实验条件下并没有催化反应。
检验 ...

谢谢。问题是不加蛋白粗提物也会进行反应，真是奇怪，我什么都不加，只加底物试试看会不会有反应。我是按照文献上说的来做的，真奇怪！
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10楼2013-10-20 10:19:45
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qapollo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-19 01:25:19
风吹我已散: 金币+2, ★有帮助 2013-10-19 09:47:42
先看看你的蛋白是什么来源。原核系统里表达的蛋白质不能正确折叠，如果你的蛋白质是真核生物的可能没有酶活。
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2楼2013-10-18 21:17:01
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
风吹我已散: 金币+2, ★有帮助 2013-10-19 09:48:25
听起来我更愿意相信你的底物不稳定
能具体说下你是催化的什么反应吗
赞一下 回复此楼
The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
3楼2013-10-18 22:34:06
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风吹我已散

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2013-10-18 22:34:06
听起来我更愿意相信你的底物不稳定
能具体说下你是催化的什么反应吗

催化乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A生成HMG-CoA和CoASH的
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4楼2013-10-19 09:47:31
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