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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶活求助啊！！！！！
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风吹我已散

木虫 (正式写手)

[求助] 酶活求助啊！！！！！

各位，求救!!!!!!!!!
我是要测一个在大肠杆菌里面异源表达的一个蛋白的酶活，这个酶原则上来说，可以催化A和B生成C和D，反应是不可逆的。然后我就摇菌，IPTG诱导，超声破碎（PBS缓冲液+BSA+10%甘油）提蛋白，然后分光光度计测底物A的变化。变化是有了，可是负对照（不加IPTG诱导）也有变化啊（底物A的吸收值下降的程度和我加IPTG诱导后蛋白提取物的结果差不多）。然后我怀疑是不是我的这个转化后的大肠杆菌可以表达微量的目的蛋白，这微量的蛋白足以催化我的反应？
于是我把蛋白换成是蛋白提取液（PBS缓冲液+BSA+10%甘油），再加两个底物A和B，结果，悲催了，分光光度计显示的变化和之前的实验结果一样！！！！！！！！！！
酶活实验步骤：1，空白对照（Tris+双蒸水+蛋白粗提物+BSA), Measure Blank
                         2，Tris+双蒸水+BSA+底物A, Measure Sample(底物A在A 300nm有最大吸收峰）
                         3， 加蛋白粗提物，Measure Sample
                         4，加底物B，Measure Sample（所有实验在此时，A 300nm下降剧烈，吸收值约变为之前的1/4）。不知道是什么原因，我原本想着可能是目的蛋白在大肠杆菌里面的微量表达也注意催化我的反应；可是不加蛋白，将试验中加蛋白的步骤换成是蛋白提取液（PBS缓冲液+BSA+10%甘油）， 分光光度计显示的结果也基本一样，到底是什么原因呢？是BSA的干扰么？还是？？？？？？
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1楼 2013-10-18 19:40:33
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qapollo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-19 01:25:19
风吹我已散: 金币+2, ★有帮助 2013-10-19 09:47:42
先看看你的蛋白是什么来源。原核系统里表达的蛋白质不能正确折叠，如果你的蛋白质是真核生物的可能没有酶活。
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2楼2013-10-18 21:17:01
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
风吹我已散: 金币+2, ★有帮助 2013-10-19 09:48:25
听起来我更愿意相信你的底物不稳定
能具体说下你是催化的什么反应吗
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
3楼2013-10-18 22:34:06
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风吹我已散

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2013-10-18 22:34:06
听起来我更愿意相信你的底物不稳定
能具体说下你是催化的什么反应吗

催化乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A生成HMG-CoA和CoASH的
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4楼2013-10-19 09:47:31
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风吹我已散

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by qapollo at 2013-10-18 21:17:01
先看看你的蛋白是什么来源。原核系统里表达的蛋白质不能正确折叠，如果你的蛋白质是真核生物的可能没有酶活。

真核生物的，但是不加蛋白为什么也会有反应啊？
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5楼2013-10-19 09:48:13
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风吹我已散

木虫 (正式写手)
自己顶！希望有人可以解决我的问题。
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6楼2013-10-19 13:39:32
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+6, 鼓励交流 2013-10-20 09:59:46
风吹我已散: 金币+5, ★有帮助 2013-10-20 10:19:52
我个人认为可能原因如下：
1.可能是蛋白提取液（PBS缓冲液+BSA+10%甘油）中的酶蛋白的折叠形态与酶蛋白的标准品不一样。导致蛋白提取液（PBS缓冲液+BSA+10%甘油）中的酶蛋白至少在实验条件下并没有催化反应。
检验此问题可分别测定：蛋白提取液（PBS缓冲液+BSA+10%甘油）中的酶蛋白溶液的红外吸收峰和紫外吸收峰、PBS缓冲液+10%甘油的红外吸收峰和紫外吸收峰、BSA的红外吸收峰和紫外吸收峰以及酶蛋白标准品的红外吸收峰和紫外吸收峰。
比较一下：蛋白提取液（PBS缓冲液+BSA+10%甘油）中的酶蛋白溶液的红外傅里叶光谱是不是大致能够用BSA的红外吸收峰和酶蛋白标准品的红外吸收峰能加上PBS缓冲液+10%甘油的红外吸收峰够线性叠加而获得。如果能够获得，则可能是蛋白提取液（PBS缓冲液+BSA+10%甘油）中的酶蛋白的折叠形态与酶蛋白的标准品是一样的可能性较大，但是不一定。可是如果蛋白提取液（PBS缓冲液+BSA+10%甘油）中的酶蛋白溶液的红外傅里叶光谱不能大致能够用BSA的红外吸收峰和酶蛋白标准品的红外吸收峰能加上PBS缓冲液+10%甘油的红外吸收峰够线性叠加而获得，那么可以肯定酶蛋白在提取液中的折叠状态与标准品不一样。
如果以上的红外光谱线性叠加实验是肯定的结果，那么就还需要测丁和对比紫外光谱实验。步骤如下：
把蛋白提取液（PBS缓冲液+BSA+10%甘油）中的酶蛋白用低温低速搅拌前后分别测定红外吸收峰和紫外吸收峰是否变化，如果明显的变化，那可能BSA与酶蛋白发生了相互作用，反之则没有相互作用。
要是有经费，当然也可以用MALDI-MS测定蛋白提取液（PBS缓冲液+BSA+10%甘油）中的酶蛋白与BSA是否发生了相互作用，不过没有必要，而且酶蛋白与BSA发生了相互作用MALDI-MS也不是每一次都能测定出来。
用Pull down也可以测定蛋白提取液（PBS缓冲液+BSA+10%甘油）中的酶蛋白与BSA是否发生了相互作用，不是也同样没有必要。用红外和紫外已经够了，最后再测一下CD和荧光光谱。
2.蛋白提取液中的PBS缓冲液和10%甘油可能干扰了催化反应，用超滤分别去除掉PBS缓冲液和10%甘油，看一下催化效果，即可判定。
3.蛋白提取液（PBS缓冲液+BSA+10%甘油）pH不适合催化反应。把pH调到最师范反应条件再试试。
4.底物浓度、酶浓度不适合。调整一下反应体系中的底物浓度、酶浓度。
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7楼2013-10-19 14:50:13
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
更正：3.蛋白提取液（PBS缓冲液+BSA+10%甘油）pH不适合催化反应。把pH调到最适合的反应条件再试试。
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8楼2013-10-19 15:26:22
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qapollo

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 风吹我已散 at 2013-10-19 09:48:13
真核生物的，但是不加蛋白为什么也会有反应啊？...

酶的作用是降低反应发生的条件和催化反应速率。有些反应能够自发完成，只是速率较低或是产物很少。另外也和实验条件有关。
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9楼2013-10-20 01:53:35
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风吹我已散

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-10-19 14:50:13
我个人认为可能原因如下：
1.可能是蛋白提取液（PBS缓冲液+BSA+10%甘油）中的酶蛋白的折叠形态与酶蛋白的标准品不一样。导致蛋白提取液（PBS缓冲液+BSA+10%甘油）中的酶蛋白至少在实验条件下并没有催化反应。
检验 ...

谢谢。问题是不加蛋白粗提物也会进行反应，真是奇怪，我什么都不加，只加底物试试看会不会有反应。我是按照文献上说的来做的，真奇怪！
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10楼2013-10-20 10:19:45
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