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cfmzxf84

木虫 (正式写手)

[求助] 求助,如何用发光法测定酶活Km值

我的酶本身是发光酶,通过加入底物就可以发光了。求教怎么测定底物的Km值,1/v~1/s法中的v怎么确定呢?谢谢
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imyting

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
cfmzxf84: 金币+5 2012-04-11 08:11:47
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-04-11 13:40:31
不太确定,首先你的底物加上去之后其发光强度必须和时间有关系,这样你就可以通过检测发光强度与时间来作图,确定一定底物浓度下的反应速度了。然后再双倒数作图。
悠哉游哉做实验,成兮败兮我随便
2楼2012-04-10 10:50:25
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cfmzxf84

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by imyting at 2012-04-10 10:50:25:
不太确定,首先你的底物加上去之后其发光强度必须和时间有关系,这样你就可以通过检测发光强度与时间来作图,确定一定底物浓度下的反应速度了。然后再双倒数作图。

是成关系的,如图
随着时间的延长,发光度下降
具体可以怎么做呢?谢谢
这是0.5min开始测的图
我试验反应是取15min的点


3楼2012-04-11 08:10:23
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imyting

至尊木虫 (正式写手)

你这只是一个底物浓度,你需要选择至少5个底物浓度,每个底物浓度测三次平行试验;然后做切线(如图,也可直接取前面几个点做线性回归),切线斜率的相反数就是初速度了,有了初速度和底物浓度,后面就不用多说了吧?就是双倒数作图了,注意单位换算就好!


悠哉游哉做实验,成兮败兮我随便
4楼2012-04-11 09:08:57
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angler5156

银虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by imyting at 2012-04-11 09:08:57
你这只是一个底物浓度,你需要选择至少5个底物浓度,每个底物浓度测三次平行试验;然后做切线(如图,也可直接取前面几个点做线性回归),切线斜率的相反数就是初速度了,有了初速度和底物浓度,后面就不用多说了吧 ...

这个切线如何选定,如何判定都很不明确啊。同酶的浓度,不同底物浓度,如何选择呢。
5楼2014-01-02 10:57:19
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