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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】酶活测定求助
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lly198784

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】酶活测定求助 已有6人参与

求助测：烟酸磷酸核糖转移酶（NAPRTase)的酶活测定方法。
它是催化烟酸=烟酸单核苷酸的反应的，过程中伴随有ATP+磷酸核糖焦磷酸=ADP+Pi+PPi。
一篇文献上是这样写的，但是我没有看明白。
Nicotinic acid phosphoribosyl transferase activity was measured following the formation of ADP. The reaction mixture contained 4.5 mM ATP, 1.5 mM phosphoribosyl pyrophosphate,45 mM potassium phosphate, pH 7.5, 45 mM Tris-
HCl, pH 7.5, 15 mM MgCl2, 0.15 mM nicotinate [34], 4 mM phosphoenolpyruvate, 0.2 mM NADH, 13U lactate dehydrogenase,and 13 U pyruvate kinase. The reaction was started by the addition of nicotinate. The concomitant consumption of
NADH (e340nm = 6.3 mM–1 cm–1) was monitored photometrically.
请大侠们指点指点，ADP的生成怎么测啊，没有说啊！
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1楼 2010-06-18 10:31:39
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lly198784

木虫 (正式写手)
顶！
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2楼2010-06-24 11:40:20
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xiaopeiliang

金虫 (小有名气)
lly198784(金币+1): 2010-07-09 10:58:49
340nm测辅酶NADH的吸光度啊
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3楼2010-06-26 22:26:20
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da1234mao

铁虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★
scelab(金币+5):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-06-26 23:21:05
lly198784(金币+1): 2010-07-09 10:59:25
不是很明白 我翻译下啊 英语很臭的
烟酸磷酸核糖转移酶（NAPRTase)的酶活测定方法以ADP形成来测定。反应体系中包括 4.5 mM ATP, 1.5 mM 磷酸核糖焦磷酸,45 mM 磷酸钾, pH 7.5, 45 mM Tris-
HCl, pH 7.5, 15 mM MgCl2, 0.15 mM 烟酸 , 4 mM 磷酸烯醇丙酮酸盐(或酯), 0.2 mM NADH, 13U 乳酸脱氢酶,and 13 U 丙酮酸脱氢酶， 反应由烟酸的加法开始。 的伴随消耗量NADH (e340nm = 6.3 mM–1 cm–1)测光地被监测了。

好像是直接把NADH替代了ATP，这不是实验原理是实验过程啊。
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4楼2010-06-26 22:59:22
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看天

木虫 (知名作家)
lly198784(金币+1): 2010-07-09 11:00:19
应该就是 烟酸+PRPP===烟酸单核苷酸+PPi 中间不需要消耗ATP吧？
而且我搞不明白PEP在PK作用下就直接生成ATP了 为什么文献中还外加ATP？ 至于NADH的消耗是PRY到LAC这个过程消耗的，与NAPRTase一点关系也没有呀？ 什么文献写的乱七八糟的 毙掉！
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戒嗔怒以养肝气，省言语以养神气，多读书以养质气，顺时令以养元气，不拘节以养大气，观天变以养灵气，莫强求规于运气。
5楼2010-06-27 09:11:10
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含章冰婵

金虫 (小有名气)
★ ★
看天(金币+2):新手奖励 +热心回答 2010-06-28 11:17:29
lly198784(金币+2): 2010-07-09 11:04:22
有一个例子你可以参考下：

                     己糖激酶
葡萄糖+ATP————————葡糖-6-磷酸+ADP

                               葡糖-6-磷酸脱氢酶
葡糖-6-磷酸+NADP+————————————葡糖酸-6-磷酸+NADPH

还原性NADPH在340nm有吸收高峰，而氧化型则无，因此根据它来测己糖激酶的酶活。
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6楼2010-06-27 23:17:11
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免贵姓刘

新虫 (初入文坛)
lly198784(金币+1): 2010-07-09 11:04:33
应该是在反应的同时，采用光谱检测手段检测生成物的吸光度的增加，从而对反应进程进行监测，你看看文献上用的是什么仪器，是不是stop-flow
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7楼2010-06-28 11:31:06
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lly198784

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by xiaopeiliang at 2010-06-26 22:26:20:
340nm测辅酶NADH的吸光度啊

是的，这就是实验过程！所以我不明白！
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8楼2010-07-09 10:59:56
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lly198784

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 含章冰婵 at 2010-06-27 23:17:11:
有一个例子你可以参考下：

                     己糖激酶
葡萄糖+ATP————————葡糖-6-磷酸+ADP

                               葡糖-6-磷酸脱氢酶
葡糖-6-磷酸+NADP+————————————葡 ...

没有说是什么仪器，但是好像是一种荧光标记的类似于分光光度计的仪器，我实验室没有
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9楼2010-07-09 11:05:25
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玉剑蓝

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by 含章冰婵 at 2010-06-27 23:17:11:
有一个例子你可以参考下：

                     己糖激酶
葡萄糖+ATP————————葡糖-6-磷酸+ADP

                               葡糖-6-磷酸脱氢酶
葡糖-6-磷酸+NADP+————————————葡 ...

你这个例子的详细实验的文献有没有？谢谢
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10楼2012-02-15 14:31:17
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