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【求助】超氧化物歧化酶活性测定方法 已有3人参与
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| 请教一下各位高手，有谁在做植物体超氧化物歧化酶活性试验的测定吗？或者哪位有测定方法啊（最好是标准操作方法）跪求。急切盼望回帖。谢谢！ |
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hha123
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2814502(金币+1):谢谢 2010-05-07 15:22:16
kolkata(金币+2):谢谢应助。不错，鼓励一下。 2010-05-14 21:48:31
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kolkata(金币+2):谢谢应助。不错，鼓励一下。 2010-05-14 21:48:31
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超氧化物歧化酶(suPeroXIde dIsMuTAse，简称SOD)是需氧生物中普遍存在的一种含金属酶。它与过氧化物酶、过氧化氢酶等酶协同作用防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害；超氧化物歧化酶可以催化氧自由基的歧化反应，生成过氧化氢，过氧化氢又可以被过氧化氢酶转化成无害的分子氧和水。 2O-2＋2HH2O2＋O2 2H2O22H2O＋O2 已知此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系，故成为植物逆境生理学的重要研究对象。 【原理】 依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有可氧化物存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，O2可将NBT还原为蓝色的甲，后者在560nM处有最大吸收。而超氧化物歧化酶作为氧自由基的清除剂可抑制此反应。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。一个酶活单位定义为将NBT的还原抑制到对照一半(50％)时所需的酶量。 【仪器与用具】 高速台式离心机；分光光度计；微量进样器；荧光灯(反应试管处照度为4000lX)；15MM×150MM试管；黑色硬纸套。 【试剂】 0.05Mol／L磷酸缓冲液(PH78)； 提取介质50MMol／L PH78磷酸缓冲液(内含1％聚乙烯吡咯烷酮)； 130MMol／L甲硫氨酸(MeT)溶液：称1339g MeT，用磷酸缓冲液溶解并定容至100Ml； 750μMol／LNBT：称取0.0613g NBT，用磷酸缓冲液溶解并定容至100Ml，避光保存； 100μMol／L核黄素溶液提0.0075g，定容至100Ml，避光保存，随用随配，并稀释10倍。 【方法】 1.酶液提取取一定部位的植物叶片(视需要定，去叶脉)0.5g于预冷的研体中，加2Ml预冷的提取介质在冰浴下研磨成匀浆，加入提取介质冲洗研钵，并使终体积为10Ml。取5Ml于4℃下10 000r／Min离心15Min，上清液即为SOD粗提液。 2.显色反应取透明度、质地相同的15MM×150MM试管4支，2支为测定、2支为对照，按表22-1加入试剂。 混匀后，给1支对照管罩上比试管稍长的双层黑色硬纸套遮光，与其他各管同时置于4000lx日光灯下反应20～30Min(要求各管照光情况一致，反应温度控制在25～35℃之间，视酶活性高低适当调整反应时间)。 3SOD活性测定与计算至反应结束后，用黑布罩盖上试管，终止反应。以遮光的对照管作为空白，分别在560nM波长下测定各管的吸光度，按式22-1计算SOD活性。 表22-1显色反应试剂配制表 试剂名称用量（ml)终浓度（比色时）0.05mol/L磷酸缓冲液1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol750μmol/L NBT溶液0.375μmol100μmol/L EDTA-Na2液0.310μmol20μmol/L核黄素0.32.0μmol酶液0.10对照2支管以缓冲液代替蒸馏水0.5总体积3.3SOD活性＝(A0-As)×VTA0×0.5×FW×V1（22-1） SOD比活力＝SOD总活性蛋白质浓度（22-2） 式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以每毫克蛋白酶单位、酶单位／Mg表示； A0：照光对照光管的光吸收值； AS：样品管的光吸收值； VT：样液总体积(Ml)； V1：测定时样品用量(Ml)； ＦW：样品鲜重(g)； 蛋白质浓度单位为每克鲜重含蛋白毫克数(Mg／g)。 【附注】 当测定样品数量较大时，可在临用前根据用量将表22-1中各试剂(酶液和核黄素除外)按比例混合后一次加入290Ml，然后依次加入核黄素和酶液，使终浓度不变，其余各步与上相同。 |
2楼2010-05-06 16:09:35
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hha123
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