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【求助/交流】果胶脂酶的酶活力测定 已有4人参与
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| 我查的用pH-stat法，可是具体步骤不知道是什么，用氢氧化钠滴定，计时从何时开始计，什么时候结束，这些具体要求是什么？酶液的pH有什么要求，哪位大虾帮忙讲讲，具体点的，谢谢啦 |
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2楼2011-03-28 22:56:37
3楼2011-04-13 15:36:33
mche2005
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rainwander(金币+2, EPI+1): 鼓励交流~ 2011-04-13 18:14:25
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这是我整理了好几天的果胶酯酶酶活测定分析方法。 可以直接用 果胶酯酶活力测定方法 1．测定方法 1.1方法 中和法。 1.2原理 果胶酯酶作用于果胶产生果胶酸。果胶酸能与碱进行中和反应。通过酸碱溶液的比较滴定可以计算出果胶酸量。 2．主要仪器和设备 分析天平，恒温水浴锅，磁力搅拌器、滴定管、离心机 3．主要化学试剂和材料 苹果果胶(apple pectin，Degree of estrification 92%)，酯化度92%，来源于Sigma或者Fluka），氢氧化钠 4．溶液的配制 4.1 1%果胶溶液 伴随搅拌，将1.00g果胶撒于70ml水中，然后在充分搅拌下加热（不超过500C为宜） 溶解成胶状，调节pH3.5，定容至100ml，搅拌均匀后置于冰箱中备用。 4.2 0.1mol/L氢氧化钠溶液 配制氢氧化钠饱和溶液（100g水中加125g，静置数天，待碳酸钠沉降后，取上清液），稀释成0.1mol/L的浓度。 5．待测酶样的处理 5.1 液体酶 离心，上清适当稀释，使酶活力测定光吸收值在0.300—0.600。 5.2 固体曲 按干重计，称取4.0g 于三角瓶中，加水200ml(包括曲中所含水)，室温下浸提（每隔10min左右搅拌一次）或于摇床上震荡浸提0.5h,取离心上清测定。 5.3 固体酶 研磨成细粉称取1.000g于烧杯中，用少量水调成糊状，用水溶解，取离心上清。 6．酶活力的测定 取5m1质量分数为1%的果胶溶液于三角瓶中，50℃下恒温，调节pH至4.0，加入0.5ml酶液，同时开始记时，用0.01 mol/1的NaOH将pH调到4.5。果胶酯酶催化果胶水解，使体系的pH不断下降，利用自动滴定仪不断的滴入0.01 mol/1的NaOH，使体系pH始终保持在4.5。每隔1 min记一次NaOH的消耗量，反应5min，以加入的NaOH的微摩尔数----反应时间作图，由所得直线的斜率（Kx）计算果胶酯酶的活力。 取5m1质量分数为1%的果胶溶液于三角瓶中，50℃下恒温，加入0.5ml酶液，保温10min，15min，20min。立即于沸水浴中煮5min。用0.01 mol/1的NaOH将pH调到8.0。 7．酶活力单位定义 一个酶活单位：50℃下，每分钟生成的酸的微摩尔数。即PE活力单位是umol/min。 8．酶活力单位计算 设测得的酶活力为X， 则，X=（V×20×F）u/30ml（g） V ---滴定所消耗氢氧化钠溶液量(ml) 20---1ml 0.02mol/L氢氧化钠溶液中和20ul mol羧基 F---酶样稀释倍数 30---反应时间（min） |
4楼2011-04-13 17:47:29
mche2005
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