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wendywan铁杆木虫 (小有名气)
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real time PCR 结果很诡异，求助高手啊！！！
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最近一直做关于VEGF gene 的Real time PCR 试验，用的是roche 480跑的pcr。 诡异的地方在于： 1 第一次sample 浓度为50ng/ul,20ul体系上样6ul，GAPDH 作为内参，结果显示出来的CT值为9-10左右，组内有人说GAPDH一般在13-15左右才会用，低于13都不会用。觉得我应该稀释模板。但是第一次改有的趋势都正常。且BDNF作为阳性ctrl，也是正常的。 2 第二次用同样的sample做。模板浓度稀释为10ng/ul。上样5ul。还是GAPDH作为内参。这次的结果是GAPDH 的平均CT 值在14-16之间。结果目的基因出来的结果是该减少的全部增加了。不知道哪次的结果是正常的？ 想问的还有：一般在RNA提出来是测的浓度，作为矫正内参的参考。之后在测cDNA浓度是否没啥用处了，有人说在做反转时加了dNTP后，会影响吸光值，所以cDNA的浓度压根就不准。是否是这样的？ 为什么模板稀释的浓度不一样，会出现这么大的差异？像我这种情况，究竟哪次的结果比较准确？ 期待大家的帮忙啊！捉急。。。。。。。 |
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