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pingkaihe

金虫 (正式写手)

费简树森

[求助] RT-PCR的关键

刚开始进实验来做RT-PCR去P家蚕血细胞的两个基因，鼓捣了一个月了，屡次失败，想请大家交流一下自己做RT-PCR中遇到的问题及如何解决的，互相学习，共同进步了。
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慢慢积累，一步一个脚印。
1楼 2013-10-06 19:12:23
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pingkaihe

金虫 (正式写手)

费简树森
引用回帖:
5楼: Originally posted by 大鸟01 at 2013-10-21 14:40:01
p不出来是很正常的事情，我们不凡逆推下：靶基因无扩增条带，可能由以下几点因素决定1.引物设计是否合适，尤其是扩增长基因，是否考虑到了引物和靶基因之间的非特异性扩增问题，非特异性扩增严重不严重。2.扩增的酶 ...

非常感谢你的提醒，也感觉细节很重要，目前还没P出来，（1）引物无发卡结构，无二聚体，如果存在目的基因，非特异性扩增应该不会影响太多。（2）阳性对照做出来了，扩增体系应该没问题。（3）也是使用两步法。（4）文献中有报道做出来了，用oligodT做的反转录PCR。（5）现在还感觉是RNA的质量问题吧，主要是材料获取困难，为家蚕的血细胞，而家蚕血细胞量很少。提取的RNA跑电泳存在28S条带很弱，18S条带很亮的问题。
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慢慢积累，一步一个脚印。
6楼2013-10-21 19:01:45
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zgb1982

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
pingkaihe: 金币+10, ★有帮助 2013-10-07 12:24:59
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-10-21 14:51:05
你这个问题太大了，每个环节都会出现问题。很多类似的帖子可以看看。我觉得主要就是RNA要完整性要好，反转用。可靠的反转酶，cDNA质量要高，PCR过程就是体系优化和引物设计，选择好用的taq酶。没了，不知道你基因能多长。
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2楼2013-10-07 11:35:36
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zgb1982

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-29 18:35:02
引用回帖:
3楼: Originally posted by pingkaihe at 2013-10-07 12:24:37
非常感谢你的经验分享。
（1）我的基因是2000多bp，有阳性对照700bp能P出来。
（2）RNA完整性电泳检测28S确实远远没有18S亮，但5S也不亮，也没有看见降解片段，有点说昆虫血细胞RNA提取后大部分确实是这样。
（ ...

昆虫的我没接触过，我的主要是植物。我个人感觉2000+不是很好扩，我第一次扩的基因cDNA2080bp，很偶然的借用别人放了很久的cDNA居然一次就扩出来了。也没什么捷径，多试几次吧。如果RNA没问题，就看反转的cDNA了，能扩出来700bp毕竟较短，很好扩。实在不行就按你说的分段扩吧，能扩出来才是目的。
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4楼2013-10-07 13:01:10
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大鸟01

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★
pingkaihe(kx444555代发): 金币+5, 鼓励交流 2013-10-21 14:51:21
p不出来是很正常的事情，我们不凡逆推下：靶基因无扩增条带，可能由以下几点因素决定1.引物设计是否合适，尤其是扩增长基因，是否考虑到了引物和靶基因之间的非特异性扩增问题，非特异性扩增严重不严重。2.扩增的酶是否失效，这种酶的类型你了解吗（普通性、热启动型及高保真型）3.PCR体系是MIX型还是需要自己优化,用的是哪家公司的试剂盒，一般推荐用PROMEGA TAKARA QIGEN 天根;4.刚开始做实验，细节非常重要，你注意到细节没有。操作尽量在低温下进行！4.RT选用的试剂盒同3点所说，同时是否注意到是一步法还是二步法（RT步骤），个人偏向二步法。5.所用的逆转录引物，真核生物的RNA结构有POLA尾，但你要确认下你的靶基因所在的全长基因特点，是否也含POLA尾。6。逆转录可以选择随机引物或者是扩增靶基因的上游引物作为逆转录引物。7.RNA提取，你用的是什么方法，柱法、磁珠法还是trizol法各种方法效果不同，刚开始做建议先用柱法，得到的核酸比较纯。8.你所用的耗材是否注意到无核酸酶，并且操作细节上是否注意到无核酸酶的环境。
刚开始做应该注意下这些问题，并有意识的看看细节，这样的话可能对你今后的实验有帮助。呵呵，一点建议。
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立志病毒学研究
5楼2013-10-21 14:40:01
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