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pingkaihe金虫 (正式写手)
费简树森
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RT-PCR的关键
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| 刚开始进实验来做RT-PCR去P家蚕血细胞的两个基因，鼓捣了一个月了，屡次失败，想请大家交流一下自己做RT-PCR中遇到的问题及如何解决的，互相学习，共同进步了。 |
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4楼2013-10-07 13:01:10
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pingkaihe(kx444555代发): 金币+5, 鼓励交流 2013-10-21 14:51:21
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p不出来是很正常的事情，我们不凡逆推下：靶基因无扩增条带，可能由以下几点因素决定1.引物设计是否合适，尤其是扩增长基因，是否考虑到了引物和靶基因之间的非特异性扩增问题，非特异性扩增严重不严重。2.扩增的酶是否失效，这种酶的类型你了解吗（普通性、热启动型及高保真型）3.PCR体系是MIX型还是需要自己优化,用的是哪家公司的试剂盒，一般推荐用PROMEGA TAKARA QIGEN 天根;4.刚开始做实验，细节非常重要，你注意到细节没有。操作尽量在低温下进行！4.RT选用的试剂盒同3点所说，同时是否注意到是一步法还是二步法（RT步骤），个人偏向二步法。5.所用的逆转录引物，真核生物的RNA结构有POLA尾，但你要确认下你的靶基因所在的全长基因特点，是否也含POLA尾。6。逆转录可以选择随机引物或者是扩增靶基因的上游引物作为逆转录引物。7.RNA提取，你用的是什么方法，柱法、磁珠法还是trizol法各种方法效果不同，刚开始做建议先用柱法，得到的核酸比较纯。8.你所用的耗材是否注意到无核酸酶，并且操作细节上是否注意到无核酸酶的环境。 刚开始做应该注意下这些问题，并有意识的看看细节，这样的话可能对你今后的实验有帮助。呵呵，一点建议。 |
5楼2013-10-21 14:40:01
pingkaihe
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