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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 300copies/uL浓度的RNA做RT-PCR检测不出来
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feipiaolw

新虫 (初入文坛)

[求助] 300copies/uL浓度的RNA做RT-PCR检测不出来 已有2人参与

从IDT合成的microRNA，纯度应该是有保证的，以10倍稀释，共7个梯度，从300000-3copies/uL,然后反转录，300copies/uL浓度的RNA反转录就没有扩增了，3000copies/uL浓度以上的有扩增，引物和反转录试剂盒都是life公司的，反转录效率应该在90%以上，也比较小心的在干净环境下的DEPC水和除酶的管子，降解也不会很快吧？那究竟是什么原因呢？ 多谢指教
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学术一点，挺好的，要坚持
1楼 2013-09-18 16:16:17
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流 2013-09-18 22:32:03
不是每个反应都能实现单拷贝扩增的吧，或者目前的反应体系的灵敏度只能大都3000c/ul，优化一下，提高灵敏度就可以用更低的模板做出来。
当然如果RNA降解了，就又另当别论了。
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行至水穷处，坐看云起时
2楼2013-09-18 21:11:27
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妳口妳口

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
应该先反转录再稀释，浓度太低RNA容易讲解

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2013-09-19 11:42:00
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feipiaolw

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 妳口妳口 at 2013-09-19 11:42:00
应该先反转录再稀释，浓度太低RNA容易讲解

试过反转录了再稀释，情况还是一样的，300copies/uL就检测不到了。
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学术一点，挺好的，要坚持
4楼2013-09-22 10:12:30
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feipiaolw

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2013-09-18 21:11:27
不是每个反应都能实现单拷贝扩增的吧，或者目前的反应体系的灵敏度只能大都3000c/ul，优化一下，提高灵敏度就可以用更低的模板做出来。
当然如果RNA降解了，就又另当别论了。

反应条件都是ABI公司给出的，应该是优化过的，我自己也不知道该怎么改。
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学术一点，挺好的，要坚持
5楼2013-09-22 10:17:26
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huayueyang

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

RNA降解，弄外源RNA酶清除剂处理一下，台面，器材，吸头离心管啥的。、
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坚持！
6楼2013-09-24 16:20:09
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阿思only

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我想请问反转录的引物是如何得到的？用的什么引物？
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7楼2014-08-12 13:28:53
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

拷贝数的测定不准吧，按理说100个模板完全可以用PCR检测到。
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8楼2014-08-12 14:54:44
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