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feipiaolw

新虫 (初入文坛)

[求助] 300copies/uL浓度的RNA做RT-PCR检测不出来 已有2人参与

从IDT合成的microRNA,纯度应该是有保证的,以10倍稀释,共7个梯度,从300000-3copies/uL,然后反转录,300copies/uL浓度的RNA反转录就没有扩增了,3000copies/uL浓度以上的有扩增,引物和反转录试剂盒都是life公司的,反转录效率应该在90%以上,也比较小心的在干净环境下的DEPC水和除酶的管子,降解也不会很快吧?那究竟是什么原因呢? 多谢指教
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学术一点,挺好的,要坚持
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流 2013-09-18 22:32:03
不是每个反应都能实现单拷贝扩增的吧,或者目前的反应体系的灵敏度只能大都3000c/ul,优化一下,提高灵敏度就可以用更低的模板做出来。
当然如果RNA降解了,就又另当别论了。
行至水穷处,坐看云起时
2楼2013-09-18 21:11:27
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妳口妳口

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
应该先反转录再稀释,浓度太低RNA容易讲解

[ 发自小木虫客户端 ]
3楼2013-09-19 11:42:00
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feipiaolw

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 妳口妳口 at 2013-09-19 11:42:00
应该先反转录再稀释,浓度太低RNA容易讲解

试过反转录了再稀释,情况还是一样的,300copies/uL就检测不到了。
学术一点,挺好的,要坚持
4楼2013-09-22 10:12:30
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feipiaolw

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2013-09-18 21:11:27
不是每个反应都能实现单拷贝扩增的吧,或者目前的反应体系的灵敏度只能大都3000c/ul,优化一下,提高灵敏度就可以用更低的模板做出来。
当然如果RNA降解了,就又另当别论了。

反应条件都是ABI公司给出的,应该是优化过的,我自己也不知道该怎么改。
学术一点,挺好的,要坚持
5楼2013-09-22 10:17:26
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huayueyang

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

RNA降解,弄外源RNA酶清除剂处理一下,台面,器材,吸头离心管啥的。、
坚持!
6楼2013-09-24 16:20:09
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阿思only

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我想请问反转录的引物是如何得到的?用的什么引物?
7楼2014-08-12 13:28:53
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

拷贝数的测定不准吧,按理说100个模板完全可以用PCR检测到。
8楼2014-08-12 14:54:44
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