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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 切胶回收DNA失败，没经验，望指点
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美丽的家园

金虫 (正式写手)

[求助] 切胶回收DNA失败，没经验，望指点

1.        吸附柱平衡：向吸附柱CB2中加入500 μL 平衡液BL，12，000 r/min 离心 1 min,弃废液，放回收集管
2.        捣碎胶，加入5倍PB结合液，混匀。60℃水浴10 min ，直到胶溶解为止，期间上下颠倒2~3次。
3.        冷却后，加入到已经平衡好的CB2中，室温2~5 min，12，000 r/min 离心 1 min,弃废液，放回收集管
4.        加入600 μL漂洗液PW (其中含80％乙醇),放置5 min，12，000 r/min 离心 1 min,弃废液，放回收集管
5.        重复上述4操作一次
6.        12，000 r/min 离心 2 min,CB2 开盖2~5 min，并甩空柱去除残留乙醇
7.        将CB2置于干净的收集管，加入洗脱液EB 30 μL，50℃ 水浴 2min，静置2~5 min
8.        12，000 r/min 离心 1 min,管底溶液为DNA 溶液
9.        去5 μL进行0.8 ％琼脂糖电泳检测
PCR 后检测有亮带，回收失败，不知还有什么需要注意的，望指点
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1楼 2013-10-04 01:11:58
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sylar1022

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

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美丽的家园: 金币+5 2013-10-04 20:31:19
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-10-05 12:16:26
就按protocol做就行了…你是量不够或者回收率低，换个kit用吧…

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2013-10-04 08:56:38
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白菜吃虫

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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美丽的家园: 金币+5 2013-10-04 20:42:50
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-06 02:06:54
是不是PCR产物本来不是很多，你回收后电泳检测的时候上样量太少，看不到啊。
一般我都按照损失一半来算的。
不过，我很好奇你用的啥kit。啥试剂盒要用5倍PB
你前面用5倍PB，感觉胶浓度应该很大，那片段应该挺短；
可是你最后用0.8%的胶检测，又感觉片段应该挺大。
严格按照说明书做，如果回收条带很亮（正常曝光），不出来就换kit。
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3楼2013-10-04 14:28:31
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desheng101

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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美丽的家园: 金币+5 2013-10-04 20:46:35
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-10-06 02:07:00
按照说明书一步一步来，没有问题，胶回收效率本身就不是很高，楼主可以多管样品一起回收
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4楼2013-10-04 15:27:56
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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美丽的家园: 金币+5 2013-10-04 20:59:14
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-10-06 02:07:08
你5ul样品跑胶 加loading buffer了吗？
你用的KIT ，确定 是用60度溶胶？按着Protocol做
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5楼2013-10-04 16:09:40
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lyz65956

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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美丽的家园: 金币+5 2013-10-04 20:56:00
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-10-06 02:07:15
使用了多少样品进行回收？切胶是怎样操作的？
增加上样量，可以9ul PCR产物+1ul 10*loadingbuffer,多点几个孔然后一起切胶回收。其他的按照试剂盒protocol应该不会有问题
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对自己更好点
6楼2013-10-04 19:07:04
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美丽的家园

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 白菜吃虫 at 2013-10-04 14:28:31
是不是PCR产物本来不是很多，你回收后电泳检测的时候上样量太少，看不到啊。
一般我都按照损失一半来算的。
不过，我很好奇你用的啥kit。啥试剂盒要用5倍PB
你前面用5倍PB，感觉胶浓度应该很大，那片段应该挺短 ...

恩，多谢！我用的是天根公司的普通DNA产物纯化试剂盒，说明书是用5倍的结合液，文献看到有用3倍的，不知道你怎么用，其实我回收的片段在500 bp左右，胶浓度确实比较小，如果换成1.5 ％,加3倍结合液，冷却后胶不会凝了吧
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7楼2013-10-04 20:42:37
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美丽的家园

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by desheng101 at 2013-10-04 15:27:56
按照说明书一步一步来，没有问题，胶回收效率本身就不是很高，楼主可以多管样品一起回收

是将全部样品都用一支管回收？
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8楼2013-10-04 20:46:28
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美丽的家园

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lyz65956 at 2013-10-04 19:07:04
使用了多少样品进行回收？切胶是怎样操作的？
增加上样量，可以9ul PCR产物+1ul 10*loadingbuffer,多点几个孔然后一起切胶回收。其他的按照试剂盒protocol应该不会有问题

切胶样有0.5g,切胶是在紫外灯在切出大概的位置，在外面操作的，可能切到没有亮带之处，在短波长紫外灯照久了，DNA是诱变还是降解了呢？
上样我是将梳子用透明胶包起来，上样量就加大了很多，只是样品比较容易冲出到孔外。
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9楼2013-10-04 20:55:54
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小齐018

木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

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美丽的家园: 金币+5 2013-10-04 21:06:18
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-10-06 02:07:26
1.第3步之后的滤液重新过柱，重复第3部，以提高片段的吸附率！
2.第6步之后，要等乙醇挥发完之后再进行下一步，方法是用鼻子闻不到味道为止。
3.第8步之后重复一次，提高洗脱率。
希望能帮到你！
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10楼2013-10-04 20:56:28
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