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美丽的家园

金虫 (正式写手)

[求助] 切胶回收DNA失败,没经验,望指点

1.        吸附柱平衡:向吸附柱CB2中加入500 μL 平衡液BL,12,000 r/min 离心 1 min,弃废液,放回收集管
2.        捣碎胶,加入5倍PB结合液,混匀。60℃水浴10 min ,直到胶溶解为止,期间上下颠倒2~3次。
3.        冷却后,加入到已经平衡好的CB2中,室温2~5 min,12,000 r/min 离心 1 min,弃废液,放回收集管
4.        加入600 μL漂洗液PW (其中含80%乙醇),放置5 min,12,000 r/min 离心 1 min,弃废液,放回收集管
5.        重复上述4操作一次
6.        12,000 r/min 离心 2 min,CB2 开盖2~5 min,并甩空柱去除残留乙醇
7.        将CB2置于干净的收集管,加入洗脱液EB 30 μL,50℃ 水浴 2min,静置2~5 min
8.        12,000 r/min 离心 1 min,管底溶液为DNA 溶液
9.        去5 μL进行0.8 %琼脂糖电泳检测
PCR 后检测有亮带,回收失败,不知还有什么需要注意的,望指点
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美丽的家园

金虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by lyz65956 at 2013-10-04 19:07:04
使用了多少样品进行回收?切胶是怎样操作的?
增加上样量,可以9ul PCR产物+1ul 10*loadingbuffer,多点几个孔然后一起切胶回收。其他的按照试剂盒protocol应该不会有问题

切胶样有0.5g,切胶是在紫外灯在切出大概的位置,在外面操作的,可能切到没有亮带之处,在短波长紫外灯照久了,DNA是诱变还是降解了呢?
上样我是将梳子用透明胶包起来,上样量就加大了很多,只是样品比较容易冲出到孔外。
9楼2013-10-04 20:55:54
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查看全部 26 个回答

sylar1022

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
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美丽的家园: 金币+5 2013-10-04 20:31:19
gyesang: 金币+1, 鼓励交流! 2013-10-05 12:16:26
就按protocol做就行了…你是量不够或者回收率低,换个kit用吧…

[ 发自小木虫客户端 ]
2楼2013-10-04 08:56:38
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白菜吃虫

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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美丽的家园: 金币+5 2013-10-04 20:42:50
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-10-06 02:06:54
是不是PCR产物本来不是很多,你回收后电泳检测的时候上样量太少,看不到啊。
一般我都按照损失一半来算的。
不过,我很好奇你用的啥kit。啥试剂盒要用5倍PB
你前面用5倍PB,感觉胶浓度应该很大,那片段应该挺短;
可是你最后用0.8%的胶检测,又感觉片段应该挺大。
严格按照说明书做,如果回收条带很亮(正常曝光),不出来就换kit。
3楼2013-10-04 14:28:31
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desheng101

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
美丽的家园: 金币+5 2013-10-04 20:46:35
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流! 2013-10-06 02:07:00
按照说明书一步一步来,没有问题,胶回收效率本身就不是很高,楼主可以多管样品一起回收
4楼2013-10-04 15:27:56
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