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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 切胶回收DNA失败，没经验，望指点
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美丽的家园

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by liyongliangx at 2013-10-04 16:09:40
你5ul样品跑胶 加loading buffer了吗？
你用的KIT ，确定 是用60度溶胶？按着Protocol做

方案没有提到用多少度溶胶，我一开始用60度，发现不溶，升到了65度
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11楼2013-10-04 20:59:07
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美丽的家园

金虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 小齐018 at 2013-10-04 20:56:28
1.第3步之后的滤液重新过柱，重复第3部，以提高片段的吸附率！
2.第6步之后，要等乙醇挥发完之后再进行下一步，方法是用鼻子闻不到味道为止。
3.第8步之后重复一次，提高洗脱率。
希望能帮到你！

多谢！
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12楼2013-10-04 21:06:15
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白菜吃虫

铜虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-06 02:07:39
引用回帖:
9楼: Originally posted by 美丽的家园 at 2013-10-04 20:55:54
切胶样有0.5g,切胶是在紫外灯在切出大概的位置，在外面操作的，可能切到没有亮带之处，在短波长紫外灯照久了，DNA是诱变还是降解了呢？
上样我是将梳子用透明胶包起来，上样量就加大了很多，只是样品比较容易冲出 ...

当然DNA在紫外下时间越短越好，但是也没那么娇气。在紫外下切也没什么，但是要保护好眼睛更重要。切完后开紫外看看原来的位置还有没有条带。
500bp，如果没有其它条带干扰1%胶就行，3倍没问题，按说明书做。我们也用那盒子，挺好的。
量少的话多做几管，多离心几次，弄一个柱子里。
祝成功！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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13楼2013-10-05 10:24:53
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 美丽的家园 at 2013-10-04 20:59:07
方案没有提到用多少度溶胶，我一开始用60度，发现不溶，升到了65度...

一般溶胶是50-55度，65度是绝对禁止的，因为超过65度DNA会降解。。。
protocol明确写着的
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14楼2013-10-05 16:47:36
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美丽的家园

金虫 (正式写手)
???????:
14?: Originally posted by liyongliangx at 2013-10-05 16:47:36
????????50-55???65???????????????????65??DNA????????
protocol???д???...

胶是用玻璃棒???碎，胶在60度很久都??溶解，晃动也??行

[ ????С??????? ]
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15楼2013-10-05 18:19:26
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平凡乌托邦

铁虫 (正式写手)
最可能的原因是PCR产物较少，可以多P几管切！
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理想很丰满，现实很骨感
16楼2013-10-05 18:48:46
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)
???????:
15?: Originally posted by ???????? at 2013-10-05 18:19:26
胶是用玻璃棒???碎，胶在60度很久都??溶解，晃动也??行
...

??????
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17楼2013-10-05 21:00:15
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ljj0720

银虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-06 02:07:53
你胶溶解温度太高吧 一般50度就可以了 十分钟  期间每隔2分钟 上下颠倒混匀几次 绝对就溶解了 。还有 你竟然不在紫外线下切胶 ？敢问  您是怎么看到条带的  能保证把条带切完吗    当然DNA在紫外下时间越短越好，但是DNA也没那么娇气。在紫外下快点切没事的，但是要保护好眼睛更重要。切完后开紫外看看原来的位置还有没有条带。
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美丽的家园
18楼2013-10-05 21:02:38
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美丽的家园

金虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by liyongliangx at 2013-10-05 16:47:36
一般溶胶是50-55度，65度是绝对禁止的，因为超过65度DNA会降解。。。
protocol明确写着的...

我用55度溶胶,都快一个小时都不溶，胶已用玻璃棒捣的够碎，水浴期间每过2~3min就摇晃一下。我是要鉴定菌株，能否用PCR 扩增后体系代替切胶用试剂盒纯化呢？
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19楼2013-10-06 10:30:30
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美丽的家园

金虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
18楼: Originally posted by ljj0720 at 2013-10-05 21:02:38
你胶溶解温度太高吧 一般50度就可以了 十分钟  期间每隔2分钟 上下颠倒混匀几次 绝对就溶解了 。还有 你竟然不在紫外线下切胶 ？敢问  您是怎么看到条带的  能保证把条带切完吗    当然DNA在紫外下时间越短越好，但 ...

我用55度溶胶,都快一个小时都不溶，胶已用玻璃棒捣的尽量碎，水浴期间每过2~3min就上下颠倒混匀，不知你是怎样破碎胶的？
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20楼2013-10-06 10:41:23
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