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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 切胶回收DNA失败，没经验，望指点
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美丽的家园

金虫 (正式写手)

[求助] 切胶回收DNA失败，没经验，望指点

1.        吸附柱平衡：向吸附柱CB2中加入500 μL 平衡液BL，12，000 r/min 离心 1 min,弃废液，放回收集管
2.        捣碎胶，加入5倍PB结合液，混匀。60℃水浴10 min ，直到胶溶解为止，期间上下颠倒2~3次。
3.        冷却后，加入到已经平衡好的CB2中，室温2~5 min，12，000 r/min 离心 1 min,弃废液，放回收集管
4.        加入600 μL漂洗液PW (其中含80％乙醇),放置5 min，12，000 r/min 离心 1 min,弃废液，放回收集管
5.        重复上述4操作一次
6.        12，000 r/min 离心 2 min,CB2 开盖2~5 min，并甩空柱去除残留乙醇
7.        将CB2置于干净的收集管，加入洗脱液EB 30 μL，50℃ 水浴 2min，静置2~5 min
8.        12，000 r/min 离心 1 min,管底溶液为DNA 溶液
9.        去5 μL进行0.8 ％琼脂糖电泳检测
PCR 后检测有亮带，回收失败，不知还有什么需要注意的，望指点
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1楼 2013-10-04 01:11:58
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美丽的家园

金虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
18楼: Originally posted by ljj0720 at 2013-10-05 21:02:38
你胶溶解温度太高吧 一般50度就可以了 十分钟  期间每隔2分钟 上下颠倒混匀几次 绝对就溶解了 。还有 你竟然不在紫外线下切胶 ？敢问  您是怎么看到条带的  能保证把条带切完吗    当然DNA在紫外下时间越短越好，但 ...

我用55度溶胶,都快一个小时都不溶，胶已用玻璃棒捣的尽量碎，水浴期间每过2~3min就上下颠倒混匀，不知你是怎样破碎胶的？
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20楼2013-10-06 10:41:23
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sylar1022

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
美丽的家园: 金币+5 2013-10-04 20:31:19
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-10-05 12:16:26
就按protocol做就行了…你是量不够或者回收率低，换个kit用吧…

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2013-10-04 08:56:38
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白菜吃虫

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
美丽的家园: 金币+5 2013-10-04 20:42:50
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-06 02:06:54
是不是PCR产物本来不是很多，你回收后电泳检测的时候上样量太少，看不到啊。
一般我都按照损失一半来算的。
不过，我很好奇你用的啥kit。啥试剂盒要用5倍PB
你前面用5倍PB，感觉胶浓度应该很大，那片段应该挺短；
可是你最后用0.8%的胶检测，又感觉片段应该挺大。
严格按照说明书做，如果回收条带很亮（正常曝光），不出来就换kit。
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3楼2013-10-04 14:28:31
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desheng101

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
美丽的家园: 金币+5 2013-10-04 20:46:35
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-10-06 02:07:00
按照说明书一步一步来，没有问题，胶回收效率本身就不是很高，楼主可以多管样品一起回收
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4楼2013-10-04 15:27:56
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