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coolkid527铜虫 (初入文坛)
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求助！关于GST标签蛋白纯化问题~！
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目前本小虫遇到的问题是使用GST琼脂纯化含有分子伴侣的重组菌，载体为PGEX6P-1，使用分子伴侣使其从包涵体表达转变为超声后上清！但由于之前实验室内无人使用GST琼脂糖纯化，所以没步骤，没配方，配方是在网上找的，纯化： 1、 将树脂浆灌注（其中树脂为50%）。小型聚丙烯色谱管可以加载2.5ml树脂（柱床体积），用于纯化12-20mg目的蛋白。 2、 当储存缓冲液（20%乙醇）液面降到柱床上沿以下时，用5x体积1xGST Bind/Wash Buffer洗树脂。 3、 待GST Bind/Wash Buffer流到柱床上沿以下时，加入制备好的蛋白抽提液。收集流穿组分并置于冰上。 4、 以10x体积1xGST Bind/Wash Buffer洗柱，收集流穿组分并置于冰上。 5、 以3x体积1xGST Bind/Wash Buffer洗脱目的蛋白。收集洗脱组分置于冰上待后续分析。 6、 分析洗脱和穿过组分中出现的目的蛋白。若目的蛋白带的是无功能的GST则无法与树脂结合，纯化。 7、 洗脱结束后，用3-5x体积柱床体积的1xGST Bind/Wash Buffer洗涤柱子。 8、 再用3-5x柱床体积的ddH2O洗涤柱子。 9、 GST凝胶最后保存于2-3x柱床体积的20%乙醇中。 GST纯化所需试剂： 1、10xGST Bind/Wash Buffer（pH7.3）用NaOH或HCl调PH 配制500ml 10xGST Bind/Wash Buffer试剂配方： 43mM 的Na2HPO4.12H2O 需称量7.7g 14.7mM的KH2PO4 需称量1g 1.37M NaCl 需称量40.03g 27mM KCl 需称量1g 使用时稀释10x变成1xGST Bind/Wash Buffer即可。 2、1xElution Buffer 配制（现配现用，以免被氧化） 取1g还原型谷胱甘肽溶于3.25ml 10xGlutathione Reconstitution Buffer中，再加ddH2O稀释到32.5ml。 0.04g 就加1.3ml 10xGlutathione Reconstitution Buffer 溶于11.7mlddH2O 0.05g 就加1.625ml 10xGlutathione Reconstitution Buffer 溶于14.625mlddH2O 0.016g 就加0.52ml 10xGlutathione Reconstitution Buffer 溶于4.68mlddH2O 0.0308g即30.8mg 就加1ml 10xGlutathione Reconstitution Buffer 溶于9mlddH2O 10xGlutathione Reconstitution Buffer即为（500mM Tris-HCl，pH8.0） 10xPBS（7.2-7.4）配方： NaCl 需称量78.9g KCl 需称量1.5g Na2HPO4.12H2O 需称量35.8g KH2PO4 需称量2.31g 灭菌，室温保存。 使用时稀释成1xPBS，破碎前洗菌体用，有些实验室直接用其替代1xGST Bind/Wash Buffer 纯化蛋白。 纯化的蛋白杂带过多啊！纯化浓度也不稳定！在线等~急啊！~ |
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 分子生化实验经验积累 |
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说实话,根据我经验:GST树脂纯化臭名昭著 反正我所遇见的人没有不抱怨的,我以前用过glutathione sepharose 4B 两个常见的问题: 1.产物不纯;2.洗脱困难,产率低下 或许是我经验不够,反正我觉得这玩意本身就不好用 如果你只是想要一点纯的蛋白,倒也不是没办法.PGEX6P-1的质粒应该在你的蛋白和目标蛋白间有一个酶切位点,你可以购买有GSTtag的相应蛋白酶(非常贵),然后在树脂上把你的蛋白切下来,蛋白酶会挂在树脂上,不会污染你的蛋白.这样一般比较纯,但是产率不怎么好 所以,最后我还是放弃了 改了下质粒,另一端加了个his-tag把用his-tag纯化过的蛋白再挂GST柱子,纯化两遍  |
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