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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助】SDS-PAGE条带跑不出来
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ufowjing

银虫 (小有名气)

[求助] 【求助】SDS-PAGE条带跑不出来

做的10%斑马鱼肝脏匀浆，手工匀浆。匀浆后12000g离心10min，煮沸上样前12000g离心10min。
之前求助过条带很少，有同学建议用裂解液做介质匀浆。
买了索莱宝的高效RIPA裂解液，再跑出来的条带依然很少，并且染色后条带上方有竖条出现。
第一个图图上marker左边的两条是用裂解液的匀浆，再左边的两条是用PBS做的匀浆。想求助一下各位研友，条带跑不出来是样品的提取有问题吗？之前实验室的师兄用PB提取的匀浆跑出来的条带很清晰很多。
还有裂解液跑出来的条带上方为什么会有竖条出现？

第二张图的条带全是用裂解液匀浆的，条带两侧全是竖条的原因是什么？
谢谢各位研友的指导。
【求助】SDS-PAGE条带跑不出来
IMG_2105.JPG
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1楼 2013-09-22 22:11:40
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ufowjing

银虫 (小有名气)
这是第二张图
【求助】SDS-PAGE条带跑不出来-1
IMG_2101.JPG
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2楼2013-09-22 22:15:01
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-23 08:51:22
第一张图的marker跑得也不好，可能是胶没做好或者电泳的问题。第二张图marker条带分得还行，说明是样品的问题。用缓冲液匀浆条带少是因为破碎不完全或者样品蛋白浓度过低。用裂解液匀浆也是可以的，不过先要弄清楚所用裂解液的成分。如果裂解液里含有浓度过高的盐分，对SDS-PAGE的影响会很大。
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3楼2013-09-23 00:47:53
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wangpeng227

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-23 08:51:38
ufowjing: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-09-24 16:06:44
样品裂解的不好，SDS-PAGE loading buffer的量不够，条带会很难看

蛋白上的太多，条带也会很难看的，不要贪多
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4楼2013-09-23 01:17:03
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霹雳光

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ufowjing: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-09-24 16:06:51
我觉得蛋白提取的质量不是特别好
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事实证明，除了你自己，不要指望任何一个人
5楼2013-09-23 08:54:04
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ritchiejin

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ufowjing: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-09-24 16:06:57
你的上样量是多少啊，看你的marker分得还不错啊。样品这样感觉是杂质太多了。
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6楼2013-09-23 09:29:00
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makubex83

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ufowjing: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-09-24 16:07:02
应该是蛋白质浓度太高了，一般都在千分之三左右。你试着把蛋白浓度依次调低看看。
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7楼2013-09-23 13:37:17
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张力民1598

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ufowjing: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-09-24 16:07:10
你可以裂解后测一下蛋白浓度。电泳时上样量做个梯度试一下。
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8楼2013-09-23 14:07:17
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ufowjing

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-09-23 00:47:53
第一张图的marker跑得也不好，可能是胶没做好或者电泳的问题。第二张图marker条带分得还行，说明是样品的问题。用缓冲液匀浆条带少是因为破碎不完全或者样品蛋白浓度过低。用裂解液匀浆也是可以的，不过先要弄清楚所 ...

谢谢您的回答，裂解液是用的索莱宝的高效RIPA裂解液，盐分浓度过高对跑出来的条带具体会有什么影响？？
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9楼2013-09-24 15:55:15
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ufowjing

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 霹雳光 at 2013-09-23 08:54:04
我觉得蛋白提取的质量不是特别好

谢谢你的回答，那可以怎样改进呢？ 现在是用的RIPA高效裂解液冰水浴手工匀浆裂解30min
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10楼2013-09-24 15:59:39
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